The use of non-mammalian infection models to study the pathogenicity of Pseudomonas aeruginosa and members of the genus Burkholderia

Pseudomonas aeruginosa and memebers of the Burkholderia cepacia complex (Bcc) are important opportunistic pathogens, particularly for immunocompromised individuals and patients suffering from cystic fibrosis.Moreover, these bacteria can cause infections in a diverse range of species, including animals, nematodes, and plants.This allowed the development of various infection models, using the mouse or rat, the nematode Caenorhabditis elegans, larvae of the greater wax moth Galleria mellonella, Drosophila melanogaster or the alfalfa plant as an infection host.In the past few years non-mammalian infection models have become particularly attractive because they are fast, cheap and often allow high throughput screenings.In this thesis I have used and evaluated C. elegans, G. mellonella and D. melanogaster as infection hosts to investigate the virulence of various P. aeruginosa and Bcc wild type and mutant strains to identify virulence factors and to understand their importance in disease.I could show that some virulence factors are important for pathogenicity in more than one infection model, while other factors were found to be host specific.N-Acyl homoserine lactone (AHL)-dependent quorum sensing (QS), a cell-to-cell communication system that is widespread among Gram-negative bacteria, was identified as a highly conserved regulatory mechanism for expression of pathogenic traits both in Bcc strains and in the environmental P. aeruginosa isolate PUPa3.For the latter strain it could be shown that the two signaling systems present in this organism operate in parallel, in contrast to the clinical isolate PAO1, in which they are hierarchically arranged.In the case of B. cenocepacia it could be shown that siderophore production and intact LPS (lipopolysaccharide) were important for virulence in most animal models.However, I also identified several virulence factors that were required for pathogenesis in only one of the infection hosts.A major line of my research was dedicated to the identification of virulence factors of B. cenocepacia H111.To this end a random mini-Tn5 insertion library was screened in the C. elegans infection model for strains with attenuated pathogenicity.Surprisingly, none of the 22 identified mutants was defective in the biosynthesis of classical virulence factors, such proteolytic enzymes, type III, type IV or type VI secretion systems etc., rather they were found to carry mutations in central metabolic pathways.Specifically, the mutations were mapped to purA, purD, purF, and purL encoding enzymes required for purine biosynthesis, pyrD required for pyrimidine biosynthesis and aroK encoding a key enzyme of the shikimate pathway.These mutants were also attenuated in D. melanogaster and G. mellonella, II suggesting that these pathways could be valuable targets for the development of novel antimicrobials targeting Burkholderia.Another interesting result of the screen was the discovery that 3 of the attenuated mutants had lost chromosome 3 (c3).Subsequent work provided evidence that c3 is not an essential chromosomal element but a large plasmid that encodes virulence, secondary metabolism and other accessory functions in Bcc bacteria.Zusammenfassung III II.Zusammenfassung Pseudomonas aeruginosa und Stämme des Burkholderia cepacia Komplexes (Bcc) sind gefährliche opportunistische Pathogene für immungeschwächte Personen und Patienten die an cystischer Fibrose leiden.Die Bakterien können zudem auch für Infektionen bei Tieren und Pflanzen verantwortlich sein.Die Eigenschaften diverser Wirte kann genutzt werden, um die Pathogenität in verschiedenen Infektionsmodellen wie z.B. der Maus oder der Ratte, des Nematoden Caenorhabditis elegans, der grossen Wachsmotte Galleria mellonella, der Fruchtfliege Drosophila melanogaster, des Zebrafisches oder der Luzerne zu untersuchen.In den letzten Jahren gewannen wirbellose Wirtstiere in der Forschung immer mehr an Bedeutung, da schnell Ergebnisse generiert werden können; sie sind zudem sehr billig und auch Massenscreenings sind möglich.In dieser Doktorarbeit habe ich C. elegans, G. mellonella und D. melanogaster als Wirtsorganismen verwendet um die Virulenzfaktoren von verschiedenen P. aeruginosa und Bcc Wildtypen sowie deren Mutanten zu untersuchen und zu identifizieren um somit die Erkrankung an diesen Bakterien besser zu verstehen.Ich konnte zeigen, dass einige Virulenzfaktoren für die Pathogenität in mehreren Infektionsmodellen verantwortlich sind, während andere sehr wirtsspezifisch sein können.Das N-Acyl Homoserinlacton (AHL) abhängige Quorum sensing (QS) System, welches der Zell-zu-Zell Kommunikation dient, ist bei Gram-negativen Bakterien weit verbreitet.Für Stämme des Bcc als auch für den Umweltstamm P aeruginosa PUPa3 konnte aufgezeigt werden, dass das QS System hoch konserviert und für die Expression von Pathogenitätsfaktoren verantwortlich ist.Sowohl P. aeruginosa PUPa3 als auch das klinische Isolat P. aeruginosa PAO1 besitzen beide ein zweites QS System.Während die beiden Signalsysteme in PAO1 hierarchisch angeordnet sind, konnte mit Hilfe der Modellorganismen C. elegans und G. mellonella gezeigt werden, dass diese im PUPa3 Stamm unabhängig voneinander arbeiten.Für Burkholderia cenocepacia wurde gezeigt, dass die Siderophorproduktion und intakte Lipopolysaccharide (LPS ) wichtig für die Pathogenität in den meisten Tiermodellen sind.Zudem konnte ich aufzeigen, dass einige Virulenzfaktoren sehr Wirtsspezifisch sind.Die Hauptaufgabe dieser Studie war die Identifikation von Virulenzfaktoren von B. cenocepacia.Zu diesem Zweck wurden die Mutanten einer mini-Tn5 Mutantenbank mit Hilfe des Nematoden C. elegans auf deren Pathogenität untersucht und die attenuierten Stämme wurden weiter untersucht.Erstaunlicherweise befand sich keine der Mutationen der 22 gefundenen Stämme in Genen, welche für die Biosynthese klassischer Virulenzfaktoren wie Zusammenfassung IV proteolytischer Enzyme, TypIII, TypIV oder TypVI Sekretionssysteme usw.verantwortlich sind.Dafür trugen viele der gefundenen Stämme Mutationen in zentralen metabolischen Stoffwechselwegen.Insbesondere wurden Mutationen im Purin Syntheseweg (purA, purD, purF, und purL), pyrD, welcher für die Pyrimidinbiosynthese erforderlich ist und aroK, welches eines Schlüsselenzymes im Shikimatsyntheseweges kodiert, gefunden.All diese aufgelisteten Mutanten waren auch in D. melanogaster und G. mellonella attenuiert.Somit könnten diese Stoffwechselwege von besonderem Interesse für die Entwicklung neuartiger antimikrobieller Medikamente und zur Bekämpfung von Burkholderien sein.Eine weitere interessante Entdeckung des Screens war, dass drei der attenuierten Mutanten das ganze Chromosom 3 (C3) verloren hatten.Durch weitere Forschung an diesen Stämmen konnte gezeigt werden, dass C3 durch seine Eigenschaften eher als riesiges Plasmid zu bezeichnen ist, welches unter anderem Virulenzfaktoren, sekundär Metaboliten und andere Zusatzfunktionen in Bcc Bakterien kodiert.

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