Biotransformation du glycérol brut en lipides par microorganismes hétérotrophes (levures) pour la production de biodiésel.

La recherche de nouvelles sources énergétiques représente une voie d’étude importante au regard des problèmes environnementaux liés à la forte consommation d’énergie fossiles (huiles lourdes, essence, diesel, gaz, etc.). Il s’agit aujourd’hui de mettre en oeuvre des matières premières ou d’énergies renouvelables obtenues à partir de biomasse d'origine végétale, animale ou suite à de nouvelles transformations chimiques. Dans ce contexte, les huiles issues de microorganismes oléagineux produits à partir de ressources renouvelables comme le glycérol, les huiles végétales, les déchets agro-résiduels, déchets solides et liquides municipaux, les résidus forestiers et autres déchets industriels couvrant une richesse organique, pouvant être microbiologiquement assimilable, représentent des avenues potentielles. Actuellement, divers carburants renouvelables principalement le bioéthanol sont produits à partir de mélasses ou d'autres sucres fermentescibles facilement disponibles. Par ailleurs, la synthèse de lipides microbiens constitue un mécanisme biologique fondé et bien connu notamment de par la production industrielle des TAGs (Triacylglycérols). Ces microorganismes possèdent un large éventail de propriétés physiologiques et métaboliques pour l’utilisation de substrats multiples. Les microbes oléagineux accumulent des lipides intracellulaires variant de 20 à 85% (p/p) de la biomasse cellulaire totale sèche. Compte tenu de ces propriétés avantageuses, le glycérol ainsi que certains déchets agro-industriels font l’objet d’études comme sources de carbone ou substrats assimilables pour la production de lipides. 
\nDes échantillons de sol prélevés à partir de milieux forestiers vierges et autres sols contaminés par des déversements accidentels de glycérol ont été sélectionnés et reproduits dans des milieux de cultures sélectifs supplémentées de glycérol. Des souches de bactéries, de levures et des champignons filamenteux sont apparus dans les 48h suivant l'incubation et ont été acheminés pour des analyses plus poussées. Tous les isolats ont été cultivés dans du glycérol brut (GB) enrichi avec une limitation d’azote pendant 120h. Les cellules récoltées après incubation ont été colorées avec le Soudan noir B et observées au microscope à contraste de phases. Les organismes ayant révélés des globules d'huile en observation microscopique sur lame fixe, ont été sélectionnés pour un criblage secondaire subséquent. Tous les organismes ont été initialement identifiés par Biolog suivi de séquençage (ADNr 18S). Dans le criblage secondaire, une concentration GB de 100 g/L et deux différents ratios molaires C/N ont été choisis. La fermentation a été menée jusqu'à 120h après l’inoculation des souches. Sur la base des résultats obtenus, la souche SKY7 (teneur en lipides de 45% en p/p) a été sélectionnée pour les étapes subséquentes. 
\nSKY7 a été identifiée comme Yarrowia lipolytica par la méthode biochimique et génomique via le séquençage d’ADNr 18S. Cette souche est bien connue comme oléagineuse, elle est aussi dotée de la production d’acide citrique et surtout capable d'utiliser une large gamme de substrats. Par ailleurs, les paramètres de culture ont été évalués pour Y.lipolytica SKY7 afin d'obtenir une production optimisée en lipides intracellulaires. Les expériences menées en erlenmeyer à petite échelle initiale ont été réalisées à différentes concentrations de glycérol, rapport molaire C/N, taille de l'inoculum, et concentrations en oligo-éléments. Les meilleurs résultats (en termes de concentrations en biomasse et de lipides accumulés) ont été enregistrés avec une concentration en glycérol de 100 g/L et un ratio C/N de 100. 
\nRelativement aux résultats obtenus, la fermentation a été effectuée à plus grande échelle (réacteur de 15L de capacité totale avec un volume utile de 11L) en utilisant 100 g/L de glycérol, un rapport C/N molaire de 100 et 5% v/v d’inoculum et ce, sous 2 angles comparatifs : avec et sans contrôle du pH. La synthèse de lipides a été globalement observée entre 30 et 60h. Dans le cas des expériences à pH contrôlé, des concentrations en lipides (43,2% p/p) de 7,78g /L avec une biomasse de 18 g/L ont été atteintes. Même dans l’éventualité de résultats similaires en biomasse durant la fermentation, la condition de pH non contrôlé démontre des concentrations significativement plus faibles en lipides par rapport aux résultats d’expériences à pH contrôlé. Par conséquent, on conclut que le contrôle du pH pourrait améliorer la synthèse des lipides pendant la fermentation. De plus, à partir des résultats expérimentaux, on a supposé à partir de la littérature qu’Y.lipolytica SKY7 exigeait un rapport C/N molaire entre 350-400 pour son métabolisme en phase lipogénique. Le maintien du rapport molaire C/N dans l’intervalle indiqué étend la phase lipogénique et permet d’améliorer le rendement global de production en lipides. 
\nLa présente étude met en oeuvre le potentiel de production de lipides par Y.lipolytica SKY7 à partir d’un milieu synthétique à base de GB. Afin de maximiser la concentration en lipides et en biomasse, la méthode de plan d’expérience Box-Behnken a été adoptée et les principaux paramètres étudiés étaient les suivants : concentration de glycérol, rapport molaire C/N et volume de l'inoculum. Des concentrations de biomasse de 29,5 g /L et 50% (p/p) de lipides ont été enregistrés dans les conditions optimales (concentration de glycérol 82,5 g/L et de rapport C/N 75 avec un inoculum à 6,25% v/v). 
\nAfin d'améliorer la production en lipides à partir de microorganismes hétérotrophes, une approche alternative permettant de substituer les nutriments commerciaux a été retenue. Des sources d’azote organique et inorganique ont été ainsi remplacées par des lixiviats de silos de stockage de grains et les principaux résultats ont dévoilé qu’il s’agit d’une perspective plausible pour l’utilisation de déchets à faible coût comme source nutritive pour la synthèse de lipides microbiens. Cette approche d’utilisation de déchets à faible coût permet de démontrer l’intérêt économique et environnemental de la technologie proposée en tenant compte de trois points principaux : 1) diminution de coût de procédé ; 2) contribution à la protection de l'environnement par l'élimination des nutriments à partir de flux de déchets nuisibles et ; 3) valeur ajoutée des flux de déchets a un avantage en vue de la valorisation. 
\nEn outre, les études menées à l'échelle du fermenteur (15L) avec des ajouts de lixiviats de silos (200ml/L) ont donné lieu à une biomasse et des lipides de concentrations de 25,82 et de 15,15g/L, respectivement au bout de seulement 51h de fermentation. Les rendements de la biomasse et des lipides ainsi obtenus sont de 83,45g/mol C et 53,28g/ C mol avec une teneur en lipides de 63,85% en p/p de la masse cellulaire sèche. Toutefois, le remplacement de la source nutritive seule ne peut pas rendre le processus économiquement viable. Les conditions opérationnelles influencent vigoureusement l'économie du processus. La stérilisation des réacteurs et des milieux composants est une étape exigeante en manipulations et à haute demande en énergie. Ainsi, en éliminant cette opération, on pourrait accroître l'économie globale du procédé pour une faisabilité plus probable. 
\nUn procédé dit non stérile en présence de méthanol a été étudié pour éliminer le processus de stérilisation. Les premiers résultats obtenus à partir des expériences en erlenmeyer ont démontré une accumulation de biomasse de 9,8 g/L avec une teneur en lipides de 48% p/p quand on rajoute 3% de méthanol (v/v). Cependant, lorsque des conditions analogues ont été reproduites à l’échelle de bioréacteur, la fermentation contrôlée relevant de ce procédé a échoué (contamination observée) après 18h du début de la fermentation. Par conséquent, une autre approche alternative a été formulée. Un traitement UV d’une durée de 10 minutes a été introduit pour traiter l'eau du robinet avant son ajout comme eau de procédé servant à la dilution du milieu de culture. Grâce à ce traitement aux UV avec une addition de 3% (v/v) de méthanol, nous avons pu retarder l’apparition de la contamination jusqu’à 42h après le début de la fermentation. Il en résultait une biomasse élevée (17,57g/L) et une concentration de lipides (8,8 g/L) non négligeable via ce processus non stérile. En comparaison avec la condition expérimentale précédente (3% v/v de méthanol seul) la biomasse et la concentration des lipides ont été améliorés par des facteurs de 3 et 4, respectivement. 
\nAfin d'améliorer l'accumulation de lipides à l’intérieur des cellules microbiennes, une approche biochimique a été expérimentée. Une série de concentrations différentes en biotine (10, 50 et 100 μg/L), ajoutée en supplément au milieu de fermentation établi (précédemment) a été étudiée. 
\nEn général, la biotine est l'un des facteurs de croissance importants et nécessaires pour la synthèse des lipides membranaires (paroi cellulaire). En outre, la biotine renferme un groupement prosthétique principal (ACC- l'acétyl-CoA carboxylase) agissant par la carboxylation de l'acétyl-CoA en malonyl-CoA pour la synthèse des TAGs. Des travaux antérieurs sur l’ajout de biotine ont été rapportés pour améliorer la production d'acides gras à longue chaîne. Dans le cas présent, l'addition de 100 μg/L de biotine a notamment amélioré la concentration de lipides dans des cultures en batch de Y. lipolytica. Par rapport aux conditions de contrôle nous avons remarqué une amélioration du rendement par un facteur de 0,5 sur la concentration totale de lipides totaux extraits. Les concentrations de biomasse et de lipides réelles (expérimentales) ainsi obtenues sont de 26,56g/L de biomasse avec 10,12g/L de lipides dans les conditions de contrôle et de 27,6 g/L de biomasse et de 16.16g/L de lipides pour les études incluant la biotine. 
\nEn outre, d’autres expériences réalisées sur la production de lipase et d’aci

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