Identification of NF-κB dependent genes which are regulated by specific coactivators

Der Nukleare Faktor kappa B (NF-κB) spielt eine zentrale Rolle in vielen Entzündungs- und Nerven-zerstörenden Krankheiten, aber auch in der Entstehung von Krebs. NF-κB gehört zu einer Familie von induzierbaren Transkriptionsfaktoren, welche hauptverantwortlich sind für die Regulation von Genen, die in der Immunabwehr und in Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle spielen. Mehr als 500 verschiedene NF-κB abhängige Gene konnten bis jetzt identifiziert werden. PARP-1 ist ein Chromatin-assoziiertes Protein, welches in hohen Mengen im Zellkern vorkommt und zu einer grossen Familie von Enzymen gehört, welche ADP-Ribose Einheiten von NAD als Substrat auf sich selber oder andere Chromatin-assoziierte Proteine übertragen. PARP-1 Knockout-Mäuse zeigen eine ausgesprochen hohe Resistenz gegenüber experimentell induziertem Septischem Schock, Diabetes Typ 1 und Parkinson Krankheit. Dieser Phänotyp ist ein klares Indiz dafür, dass PARP-1 in die Pathogenese dieser Prozesse involviert ist. In der Tat fungiert PARP-1 als wichtiger Koaktivator von NF-κB. Darüber hinaus wurde kürzlich in einer Studie gezeigt, dass die proteolytische Spaltung von PARP-1 durch Caspasen möglicherweise wichtig ist für die PARP-1 Aktivität in NF-κB abhängigen Krankheitsprozessen. Neben PARP-1 sind einige andere Koaktivatoren wie zum Beispiel die Koaktivator assoziierte Arginin Methyltransferase-1 (CARM-1) ebenfalls essentiell für die NF-κB abhängige transkriptionelle Aktivierung von Genen. Ziel dieser Studie war NF-κB abhängige Gene in Abhängigkeit von PARP-1 und CARM-1 zu identifizieren und darüber hinaus solche, die von der proteolytischen Spaltung von PARP-1 durch Caspasen abhängig sind. Zu diesem Zweck wurden die Expressionsstärken von Wildtyp Zellen (embryonale Mausfibroblasten, respektive Lungenfibroblasten und Raw264) mit den entsprechenden Knock-out oder Knock-in Zellen nach Stimulation verglichen. Es wurden 16 Gene von den über 500 von NF-κB abhängigen Genen untersucht. Die Resultate zeigten, dass immer nur ein Teil von den NF-κB abhängigen Genen durch die untersuchten Koaktivatoren aktiviert wird. Weiter konnte gezeigt werden, dass die Expression von NF-κB abhängigen Genen durch PARP Hemmer unter den getesteten Konditionen nicht beeinflusst wird. Andererseits scheinen einige Gene durch Caspase Aktivität, z.B. Spaltung von PARP-1, reguliert zu werden. All diese Resultate sprechen für einen starken Beweis, dass PARP-1 und CARM-1 eine essentielle Rolle in NF-κB abhängiger transkriptioneller Aktivierung von Genen spielt. Nuclear factor kappa B (NF-κB) had been suggested to play important roles in inflammatory and neurodegenerative disorders as well as carcinogenesis. NF-κB encompasses a family of inducible and widely expressed transcription factors which played a crucial role in the regulation of genes involved in immune and inflammatory responses. Over 500 target genes depending on NF-κB had been identified so far. PARP-1, an abundant nuclear chromatin associated protein belongs to a large family of enzymes that catalyze the transfer of ADP-ribose units from its substrate ?- nicotinamide adenine dinucleotide covalently to itself and other chromatin associated proteins. PARP-1 deficient mice were protected against experimentally induced septic shock, diabetes type I and Parkinsonism. This phenotype indicated that PARP-1 is important for the pathogenesis of these events. Indeed, PARP-1 was shown to be an important coactivator of NF-κB. Interestingly, recent studies had shown that the cleavage of PARP-1 by caspases could be important for the activity of PARP-1 in NF-κB- dependent disease processes. In addition to PARP-1, many other coactivators such as the coactivator-associated arginine methyltransferase-1 (CARM-1) are also required for NF-κB-dependent gene expression. Aim of this thesis was to investigate NF-κB-dependent gene expression in regard to their PARP-1 or CARM-1 dependency and furthermore to the caspase-mediated cleavage of PARP-1. For this purpose, gene expression levels of wild-type mouse lung fibroblasts, mouse embryonic fibroblasts and Raw264 cells were compared with the corresponding knock-out or knock-in cells upon stimulation. From over 500 target genes of NF-κB, 16 selected genes were analyzed. The results indicated that only a subset of the target genes were activated by the certain investigated coactivators. Moreover, PARP inhibitors did not influence NF-κB-dependent gene expression under the tested conditions. On the other hand, a small subset of NF-κB-dependent genes seemed to be regulated by caspase activities, potentially through the cleavage of PARP- 1. Together these results provide strong evidence for a crucial role of PARP-1 and CARM- 1 in NF-κB gene expression.

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