Endocrine Disrupters in Human Blood and Breast Milk: Extraction Methodologies, Cellular Uptake and Effect on Key Nuclear Receptor Functions

Indledning: Miljøet er under et konstant pres fra en lang række menneskeskabte fedtopløselige stoffer, hvoraf mange nedbrydes meget langsomt og som følge heraf kan de ophobes i organismer. Disse stoffer stammer fra mange forskellige kilder, hvoraf de største bidragydere er forbrændingsprodukter fra forbrændingsanlæg, tilsætningsstoffer fra plastik, tekniske industriprodukter, pesticider fra landbruget og nedbrydningsprodukter fra vaskemidler og detergenter. Den fælles betegnelse for disse stoffer er hormonforstyrrende stoffer (forkortet på engelsk til EDCs). Nogle EDCs er svært nedbrydelige i miljøet, og kaldes også for persistente organiske miljøgifte (forkortet på engelsk til POPs). Hormonforstyrrende stoffer er forbindelser der kan forstyrre en organismes hormonsystem ved at interagere med organismens hormonreceptorer. Mange af en organismes kropsfunktioner styres af samspillet mellem hormoner og hormonreceptorer, og forstyrrelser af dette samspil kan resultere i sygdomme og fejlfunktioner. Stoffer, som udviser hormonforstyrrende egenskaber er blevet forbundet med mange sygdomme, herunder misdannelser af kønsorganer, neurologiske lidelser, reproduktive problemer, insulinresistens og kræft. Alle levende organismer er udsat for hormonforstyrrende stoffer i komplekse blandinger, og der er derfor et behov for metoder der kan vurdere den kombinerede effekt af disse akkumulerede hormonforstyrrende stoffer på organismens kerne-hormonreceptorer såsom på østrogenreceptoren (ER), androgenreceptoren (AR) og thyroidhormonreceptoren (TR). Formål: Formålet med forskningen var 1) at isolere lav-densitet-lipoprotein (LDL) fra human serum og 2) at undersøge LDL-faciliteret optag af pesticidet p,p’-dichlorodiphenyl trichloroethane (DDT) i celler med og uden LDL-receptorer tilstede i cellemembranen; 3) at ekstrahere hormonforstyrrende stoffer fra humant serum og rense disse ekstrakter for østrogener og androgener; 4) at måle, ex vivo den kombinerede aktivitet af hormonforstyrrende stoffer ekstraheret fra serumprøver indsamlet i tre internationale studiegrupper, og endelig 5) at ekstrahere EDCs og østrogener fra brystmælk og at reducere indholdet af lipider i ekstraktet forud for analyser i et ER-reportergen assay. Metoder: Artikel I. Lipoprotein blev isoleret fra humant serum ved hjælp af ultracentrifugering. Massefylden blev justeret ved at tilsætte fast kaliumklorid til serumprøven før centrifugering, således at LDL kunne isoleres. Undersøgelser af DDT-optag blev udført ved hjælp af muse-embryonale fibroblastceller (MEF), der var genetisk modificeret således, at den ene cellelinie havde begge sine lipoproteinreceptorer i cellemembranen aktive, vild-typen (MEF-1 celler), mens den anden cellelinje havde begge sine lipoproteinreceptorer inaktiveret (MEF-4 celler). MEF-4 celler mangler derfor lav-densitet-lipoprotein receptor-relateret protein (LRP) og lav-densitet-lipoprotein receptor (LDLR), henholdsvis. Optaget blev undersøgt ved hjælp af [C-14]-DDT, der forud for eksponeringen var blevet inkuberet med forskellige koncentrationer af LDL. Til at studere receptorfunktion blev det receptor-associerede protein (RAP) inkuberet med DDT-LDL opløsningen sideløbende. RAP er et 40 kDa protein, der blokerer lipoproteinreceptorer. Artikel II. Ekstraktion af hormonforstyrrende stoffer fra serum blev gennemført med fastfase ekstraktion (SPE) sammen med væskekromatografi (HPLC). Det udnyttes, at retentionstiden for EDCs er mindre end retentionstiden for hormoner, og det muliggør fremstilling af serumekstrakter, der indeholder EDCs uden spor af endogene hormoner. Artikel III. Disse hormonfri ekstrakter blev efterfølgende analyseret i et ER transactivation assay, der er et reportergen assay, der er baseret på en stabil-transfekteret MVLN cellelinje. MVLN celler reagerer på eksponering af østrogen eller østrogenlignende kemikalier ved at udskille enzymet luciferase proportionalt med graden af receptoraktivering. Ved at måle koncentrationen af luciferase, er det derefter muligt at kvantificere graden af receptoraktivering og dermed bestemme omfanget af den hormonforstyrrende aktivitet i prøven. Artikel IV. Modermælk blev ekstraheret ved hjælp af SPE og disse ekstrakter blev yderligere behandlet ved hjælp af polyethylen membraner i et dialytisk setup (MDE ekstraktion). Formålet med dialyse var at reducere indholdet af lipider i det rå SPE ekstrakt fordi MVLN celler er sårbare over for prøver med højt lipidindhold. Østrogener nedbrydes ved ekstraktionsmetoder der inkluderer brugen af koncentreret svovlsyre og lipidreduktionen skulle derfor være skånsom. Resultater: Artikel I: Optaget af DDT i MEF celler blev kun delvist medieret af lipoproteinreceptorer. En forøgelse af LDL koncentrationen i vækstmediet resulterede i faldende optag af DDT i cellerne. Artikel II: Serum ekstrakter indeholdende EDCs og renset for endogene hormoner kunne opnås ved at anvende en kombineret SPE og HPLC procedure. Ekstrakter fra Inuit serum og PCB-spiket kontrolserum viste anti-østrogen aktivitet i de hormonfrie fraktioner, mens de efterfølgende fraktioner der indeholder endogene hormoner viste østrogen aktivitet. Artikel III: Agonistisk østrogenaktivitet kunne hovedsageligt måles i de europæiske serumekstrakter. I modsætning til dette var den største del af Inuit prøverne anti-østrogene. For Inuitter sås en invers korrelation mellem serum xenoestrogenicitet og p,p’-DDE og borderline invers til PCB-153 kunne observeres, hvorimod de europæiske studiegrupper fremkaldte en positiv og en negativ korrelation mellem xenoestrogenicitet og p,p’-DDE og PCB-153, henholdsvis. Selvom der ikke var nogen stærk korrelation for de poolede data mellem xenoestrogeniciteten og de to POP-biomarkører PCB-153 og p,p'-DDE. Artikel IV: Der kunne opnås et godt recovery af DDT ved hjælp af MDE ekstraktion, men for østrogener var recovery ikke tilstrækkeligt. Lipider i ekstraktet blev reduceret med ca. 88% efter 24 timers dialyse. Konklusioner: Artikel I: Optagelse af DDT i MEF celler foregår ved både passiv diffusion og i mindre grad via lipoprotein receptorer. I vækstmediet har DDT en præference for LDL partikler over celler, og ved eksperimentelt cellearbejde skal LDL koncentrationen være sammenlignelig for at man kan være i stand til at sammenligne forskellige undersøgelser med hensyn til optag af lipofile forbindelser i celler. Artikel II: Inuit EDC-fraktionerne indeholder høje niveauer af PCB, som er anti-østrogent. Disse resultater er sammenlignelige med resultater fra PCB spikede kontrolprøver, der understøtter dette resultat. Ved analyse af hormon-fraktionerne sås en østrogenaktivitet der viste store forskelle mellem prøver fra mænd og kvinder, hvilket antyder at østradiol var fjernet i EDC fraktion. Artikel III: De valgte POP-biomarkører for eksponerings- og receptoreffekter, isoleret set, kan ikke bruges til at beskrive en organismes EDC-byrde, fordi serum blandingsprofilen varierer geografisk. Artikel IV: Modermælksekstraktionen er egnet for EDCs, hvorimod østrogener ikke kunne ekstraheres i acceptable mængder og metoden er derfor ikke egnet til analyser, hvor østrogener skal være til stede. Lipid reduktionen var ikke tilfredsstillende for undersøgelser hvor MVLN celler skal benyttes, fordi det tilbageværende fedt i ekstrakterne dræber cellerne. Metoden er derfor ikke egnet til yderligere analyser baseret på MVLN celler.

Fetched live from OpenAlex and de-inverted. Abstracts are not stored in this database: the inverted indexes are 8.6 GB of the frame’s 9.3 GB of text, and the host has 13 GB free.