Extraction, purification et caractérisation\ndâisoformes dâhexokinase\ndu tubercule de pomme de terre (Solanum tuberosum)

L’hexokinase (HK) est la première enzyme du métabolisme des hexoses et catalyse la \nréaction qui permet aux hexoses d’entrer dans le pool des hexoses phosphates et donc par le \nfait même la glycolyse. Bien que le glucose soit son principal substrat, cette enzyme peut \naussi phosphoryler le mannose et le fructose. Malgré son importance dans le métabolisme \nprimaire, l’HK n’a jamais été purifiée à homogénéité sous forme native. Le but de ce travail \nétait donc de purifier une isoforme d’HK à partir de tubercule de Solanum tuberosum et par \nla suite de caractériser ses propriétés cinétiques. \nBien avant que je commence mon travail, un groupe de recherche avait déjà séparé et \npartiellement purifié trois isoformes d’HK de S. tuberosum. Un protocole d’extraction était \ndonc disponible, mais l’HK ainsi extraite était peu stable d’où le besoin d’y apporter \ncertaines modifications. En y ajoutant certains inhibiteurs de protéases ainsi qu’en \nmodifiant les concentrations de certains éléments, le tampon d’extraction ainsi modifié a \npermis d’obtenir un extrait dont l’activité HK était stable pendant au moins 72h après \nl’extraction, en empêchant la dégradation. \nÀ l’aide du tampon d’extraction optimisé et d’une chromatographie sur colonne de butyl \nsépharose, il a été possible de séparer 4 isoformes d’HKs. Par la suite, une isoforme d’HK \n(HK1) a été purifiée à l’homogénéité à l’aide de 5 étapes de chromatographie \nsupplémentaires. En plus de caractériser les propriétés cinétiques de cette enzyme, l’analyse \nde séquençage par MS/MS a permis de l’associer au produit du gène StHK1 de Solanum \ntuberosum. Avec une activité spécifique de 10.2 U/mg de protéine, il s’agit de l’HK \npurifiée avec l’activité spécifique la plus élevée jamais rapportée d’un tissu végétal.L’ensemble des informations recueillies lors de la purification de HK1 a ensuite été utilisée \npour commencer la purification d’une deuxième isoforme (HK3). Ce travail a permis de \ndonner des lignes directrices pour la purification de cette isoforme et certains résultats \npréliminaires sur sa caractérisation enzymatique.

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