Étude du rôle de la E3 ubiquitine ligase RFWD3 en réponse au stress réplicatif

Les cellules sont constamment soumises à des sources endogènes et exogènes de dommages à l’ADN pouvant conduire à l’accumulation de mutations et au développement de pathologies telles que le cancer. Parmi les sources endogènes, le stress réplicatif est un obstacle majeur au maintien de l’intégrité génomique qu’il est nécessaire de préserver avant la duplication des cellules. Les mécanismes de tolérance au stress réplicatif sont essentiels à la survie des cellules saines. En revanche, dans un contexte de pathologie cancéreuse, de nombreux agents chimiothérapeutiques visent particulièrement à cibler la réplication afin d’induire un stress délétère important pour pouvoir tuer spécifiquement les cellules tumorales qui ont un taux de réplication plus élevé que les cellules saines. Si les traitements actuels sont relativement efficaces, l’émergence de cellules cancéreuses résistantes aux agents chimiothérapeutiques est fréquente, car celles-ci sont capables de s’adapter et d’utiliser des voies alternatives de réparation et de tolérance leur permettant de faire face aux dommages causés par les réactifs. Le but de ce projet de recherche s’inscrit dans une motivation d’approfondir les connaissances des mécanismes moléculaires de réponse au stress réplicatif. Nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux rôles de deux E3 ubiquitine ligases PRP19 et RFWD3, dans la réponse au stress réplicatif. Ces deux protéines sont connues pour être localisées aux sites de dommages à l’ADN, via leur interaction avec RPA, un facteur clé, senseur de la voie de signalisation du stress réplicatif ATR-CHK1. PRP19 et RFWD3 sont importants pour l’ubiquitination de RPA et favorisent la réparation par recombinaison homologue. En revanche leurs mécanismes d’action précis aux sites de dommages restent encore flous. L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle importante dans la modulation et la régulation de la réponse aux dommages au même titre que la phosphorylation ou l’acétylation. De ce fait, il est concevable d’imaginer que PRP19 et RFWD3, via leur activité E3 ubiquitine ligase, régulent une panoplie de facteurs, en plus de RPA, pour moduler la réponse aux dommages à l’ADN. Actuellement, PRP19 et RFWD3 ont des substrats encore peu connus ce qui nous laisse un large éventail de recherche concernant l’identification de nouveaux facteurs potentiellement ubiquitinés par ces deux E3 ubiquitine ligases. Dans un premier manuscrit, nous avons tenté de caractériser au mieux comment PRP19 favorise l’ubiquitination de RPA aux fourches de réplications bloquées. Ainsi nous avons découvert que PRP19 collabore avec RFWD3 pour ubiquitiner RPA et qu’aucune de ces deux E3 ubiquitine ligases n’est suffisante à elle seule. Nous avons également montré que PRP19 interagit avec la forme phosphorylée de RPA, grâce à un patch chargé positivement présent sur son domaine WD40, pour être recruté aux sites de dommages tandis que RFWD3 interagit de façon constitutive avec RPA. Le recrutement de PRP19 permet ainsi l’activation d’ATR nécessaire à l’hyper-phosphorylation de RPA et tous ces évènements semblent fonctionner dans une boucle d’amplification positive pour favoriser l’ubiquitination de RPA par PRP19 et RFWD3. Nous avons également caractérisé les interactomes de PRP19 et RFWD3 en réponse au stress réplicatif afin d’identifier de nouveaux facteurs jouant un rôle dans la réponse aux dommages à l’ADN et dont la fonction serait potentiellement modulée par leur ubiquitination. Dans le second manuscrit que je présente dans cette thèse, nous avons focalisé notre attention sur les résultats issus de l’interactome de RFWD3. Nous avons identifié parmi ces interacteurs la translocase SMARCAL1 (SWI/SNF2-related, matrix-associated, actin dependent regulator of chromatin subfamily A-like 1), un facteur essentiel pour la réversion des fourches de réplication en réponse au stress réplicatif. Mes travaux montrent que RFWD3 ubiquitine SMARCAL1 pour le désengager des fourches de réplication bloquées et empêcher la formation de fourches aberrantes clivées par MUS81 et délétères pour la cellule. Nous montrons aussi qu’en réponse aux rayons ultraviolets, la déplétion de RFWD3 induit une accumulation de RPA-ADN simple brin qui est partiellement dépendante de SMARCAL1 et MUS81 suggérant que RFWD3 régule également d’autres facteurs qui sont impliqués dans la réparation des trous (nicks) d’ADN simple brin induits par les ultraviolets. Nous avons pu caractériser l’une des fonctions de RFWD3 dans la réponse au stress réplicatif qui est la modulation de la fourche de réplication via la régulation de la localisation de SMARCAL1 sur RPA médiée par son ubiquitination en réponse au stress réplicatif, cependant, il reste encore de nombreuses pistes à étudier. En effet, l’identification des différents interacteurs de PRP19 et RFWD3 nous permettent de suggérer des rôles dans la régulation de différents facteurs importants pour la réponse au stress réplicatif. L’émergence fréquente de cellules cancéreuses résistantes aux traitements chimiothérapeutiques existants a encouragé le développement d’inhibiteurs de la réponse au stress réplicatif (e.g. inhibiteurs des kinases ATR et CHK1) pour améliorer l’efficacité des traitements actuels. Dans ce contexte, étudier et caractériser avec précision les mécanismes impliqués dans la réponse au stress réplicatif constitue un enjeu important pour le développement de nouvelles cibles thérapeutiques.

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