Derivati piridin-2-oni quali potenziali modulatori allosterici del recettore cannabinoide CB2

Il sistema endocannabinoide (ECS) è un sistema endogeno neuromodulatorio ad ampio raggio coinvolto nella regolazione di molte funzioni del corpo umano. E’ costituito dai recettori cannabinoidi CB1 e CB2, entrambi appartenenti alla famiglia dei recettori accoppiati a proteine G (GPCRs), dai ligandi endogeni noti come endocannabinoidi (ECs) di cui i principali sono l’anandamide (AEA) e il 2-arachidonoilglicerolo (2-AG), e dagli enzimi deputati alla biosintesi, al trasporto (FAAH, MAGL, ABHD6, ABHD12) ed alla degradazione (EMT) degli endocannabinoidi. Mentre il recettore CB1 è maggiormente espresso a livello del sistema nervoso centrale, il recettore CB2 è principalmente espresso nelle cellule associate al sistema immunitario, dove modula la migrazione cellulare e il rilascio di citochine, moderatamente a livello periferico e in misura minore anche nel SNC, soprattutto nella microglia. Questa ampia distribuzione dei CBR e il loro coinvolgimento in numerosi processi fisiologici ha incoraggiato negli anni la ricerca verso l’identificazione e la caratterizzazione farmacologica di ligandi ortosterici dei CBRs, come potenziali farmaci per il trattamento di diverse patologie. Nonostante queste ottime premesse ad oggi solo poche molecole di questo tipo hanno ottenuto l’approvazione normativa per determinate indicazioni in quanto presentano numerosi effetti collaterali tra cui effetti psicoattivi, ansia, depressione o immunodepressione, che hanno inevitabilmente limitato lo sviluppo clinico di nuovi potenziali farmaci. Al fine di ovviare a questi effetti collatarali, negli ultimi anni sono stati sviluppati approcci alternativi di modulazione dell’ECS, tra i quali è da annoverare la modulazione allosterica. I modulatori allosterici sono molecole capaci di legare siti topograficamente e strutturalmente distinti dal sito ortosterico, a livello del quale inducono una modificazione conformazionale che si rifletterà a sua volta sull’affinità e/o sull’efficacia del ligando ortosterico per il recettore. Infatti, essi possono essere classificati in: • Modulatori allosterici positivi (PAMs): aumentano l’attività del ligando ortosterico e/o la sua attività funzionale a livello del recettore • Modulatori allosterici negativi (NAMs): al contrario dei PAM, inibiscono l’attività del ligando ortosterico e/o la sua attività funzionale a livello del recettore • Ago-PAMs o allo-antagonists: composti capaci di espletare rispettivamente una funzione agonista o antagonista anche in assenza di ligando ortosterico • Ligandi allosterici neutrali (NALs): non influenzano la risposta dovuta al ligando ortosterico ma possono competere con un PAM o un NAM al livello del sito recettoriale. I modulatori allosterici offrono diversi vantaggi rispetto ai ligandi ortosterici: maggiore specificità per il sottotipo recettoriale (la sequenza amminoacidica a livello dei siti allosterici risulta meno conservata); selettività tissutale (l’effetto si esplica solo dove sono presenti i ligandi endogeni); saturabilità dell’effetto; “signalling” preferenziale e “probe” -dipendenza, ovvero la capacità di attivare selettivamente certe vie di segnale rispetto ad altre, anche a seconda del ligando ortosterico che interagisce con il recettore. Nel laboratorio dove ho svolto la tesi è stato sintetizzato il primo PAM del CB2R, l’EC21a. Il suo comportamento allosterico è stato evidenziato inizialmente con saggi di binding a livello del CB2R in cui è stata evidenziata un’aumentata affinità di legame da parte dell’agonista ortosterico di riferimento [3H] CP55940. Successivamente i saggi funzionali GTPγS, cAMP e beta arrestina, hanno mostrato come EC21a fosse in grado di aumentare l’attività del CP55940 e, nel caso del GTPγS, anche dell’endocannabinoide 2-AG ma non dell’AEA. Gli stessi saggi funzionali sono stati svolti anche in assenza del ligando endogeno di riferimento e l’EC21a non ha mostrato alcuna attività, risultato in linea con la sua natura di puro PAM. E’ stato infine testato anche in vivo sia in un modello murino di dolore neuropatico rivelando una promettente azione antinocicettiva, che in un modello di epilessia mostrando una importante azione anticonvulsiva. Durante il mio periodo di tesi ho sintetizzato nuovi derivati dell’EC21a (composti A in tabella) andando a modificare in particolare la posizione 4 dell’anello piridinico, per ampliare le conoscenze riguardo la struttura-attività (SAR) di questa classe di composti. Fino ad ora le uniche modifiche apportate in questa posizione sono state la sostituzione del metile con un gruppo ossidrilico o la sua eliminazione. In entrambi i casi i risultati erano stati negativi. Il mio lavoro di tesi si è quindi incentrato nel sostituire il metile con altri gruppi con differenti caratteristiche stereo-elettroniche ed in particolare il metile è stato sostituito con sostituenti aromatici, quali il fenile (A1) e il p-metossifenile (A2), un atomo di cloro (A3), e gruppi etereo (A4) ed ammino (A5) alchilici. I composti A1-A5 verranno testati presso l’Università di Saskatchewan, nel laboratorio del Dr Laprairie con opportuni saggi sia di binding che funzionali allo scopo di valutare il loro profilo allosterico.

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