Improving a Designed Photocontrolled DNA-Binding Protein
Notice bibliographique
Résumé
Photocontrolled transcription factors could be powerful tools for probing the roles of transcriptional processes in a variety of settings. Previously, we designed a photocontrolled DNA-binding protein based on a fusion between the bZIP region of GCN4 and photoactive yellow protein from Halorhodospira halophila [Morgan, S. A., et al. (2010) J. Mol. Biol. 399, 94-112]. Here we report a structure-based attempt to improve the degree of photoswitching observed with this chimeric protein. Using computational design tools PoPMuSiC 2.0, Rosetta, Eris, and bCIPA, we identified a series of single- and multiple-point mutations that were expected to stabilize the folded dark state of the protein and thereby enhance the degree of photoswitching. While a number of these mutations, particularly those that introduced a hydrophobic residue at position 143, did significantly enhance dark-state protein stability as judged by urea denaturation studies, dark-state stability did not correlate directly with the degree of photoswitching. Instead, the influence of mutations on the degree of photoswitching was found to be related to their effects on the degree to which DNA binding slowed the pB to pG transition in the PYP photocycle. One mutant, K143F, caused an ∼10-fold slowing of the photocycle and also showed the largest difference in the apparent K(d) for DNA binding, 3.5-fold lower, upon irradiation. This change in the apparent K(d) causes a 12-fold enhancement in the fraction bound DNA upon irradiation due to the cooperativity of DNA binding by this family of proteins. The results highlight the strengths and weaknesses of current approaches to a practical problem in protein design and suggest strategies for further improvement of designed photocontrolled transcription factors.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».