A novel mass spectrometry-based assay for GSK-3β activity
Notice bibliographique
Résumé
BACKGROUND: As a component of the progression from genomic to proteomic analysis, there is a need for accurate assessment of protein post-translational modifications such as phosphorylation. Traditional kinase assays rely heavily on the incorporation of gamma-P32 radiolabeled isotopes, monoclonal anti-phospho-protein antibodies, or gel shift analysis of substrate proteins. In addition to the expensive and time consuming nature of these methods, the use of radio-ligands imposes restrictions based on the half-life of the radionucleotides and pose potential health risks to researchers. With the shortcomings of traditional assays in mind, the aim of this study was to develop a high throughput, non-radioactive kinase assay for screening Glycogen Synthase Kinase-3beta (GSK-3beta) activity. RESULTS: Synthetic peptide substrates designed with a GSK-3beta phosphorylation site were assayed with both recombinant enzyme and GSK-3beta immunoprecipitated from NIH 3T3 fibroblasts. A molecular weight shift equal to that of a single phosphate group (80 Da.) was detected by surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) in a GSK-3beta target peptide (2B-Sp). Not only was there a dose-dependent response in molecular weight shift to the amount of recombinant GSK-3beta used in this assay, this shift was also inhibited by lithium chloride (LiCl), in a dose-dependent manner. CONCLUSION: We present here a novel method to sensitively measure peptide phosphorylation by GSK-3beta that, due to the incorporation of substrate controls, is applicable to either purified enzyme or cell extracts. Future studies using this method have the potential to elucidate the activity of GSK-3beta in vivo, and to screen enzyme activity in relation to a variety of GSK-3beta related disorders.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,002 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,002 | 0,002 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».