Reduction Precedes Cytidylyl Transfer without Substrate Channeling in Distinct Active Sites of the Bifunctional CDP-Ribitol Synthase from <i>Haemophilus influenzae</i>
Notice bibliographique
Résumé
CDP-ribitol synthase is a bifunctional reductase and cytidylyltransferase that catalyzes the transformation of D-ribulose 5-phosphate, NADPH, and CTP to CDP-ribitol, a repeating unit present in the virulence-associated polysaccharide capsules of Haemophilus influenzae types a and b [Follens, A., et al. (1999) J. Bacteriol. 181, 2001]. In the work described here, we investigated the order of the reactions catalyzed by CDP-ribitol synthase and conducted experiments to resolve the question of substrate channeling in this bifunctional enzyme. It was determined that the synthase first catalyzed the reduction of D-ribulose 5-phosphate followed by cytidylyl transfer to D-ribitol 5-phosphate. Steady state kinetic measurements revealed a 650-fold kinetic preference for cytidylyl transfer to D-ribitol 5-phosphate over D-ribulose 5-phosphate. Rapid mixing studies indicated quick reduction of D-ribulose 5-phosphate with a lag in the cytidylyl transfer reaction, consistent with a requirement for the accumulation of K(m) quantities of D-ribitol 5-phosphate. Signature motifs in the C-terminal and N-terminal sequences of the enzyme (short chain dehydrogenase/reductase and nucleotidyltransferase motifs, respectively) were targeted with site-directed mutagenesis to generate variants that were impaired for only one of the two activities (K386A and R18A impaired for reduction and cytidylyl transfer, respectively). Release and free diffusion of the metabolic intermediate D-ribitol 5-phosphate was indicated by the finding that equimolar mixtures of K386A and R18A variants were efficient for bifunctional catalysis. Taken together, these findings suggest that bifunctional turnover occurs in distinct active sites of CDP-ribitol synthase with reduction of D-ribulose 5-phosphate and release and free diffusion of the metabolic intermediate D-ribitol 5-phosphate followed by cytidylyl transfer.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».