Critical Residues for the Specificity of Cofactors and Substrates in Human Estrogenic 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase 1: Variants Designed from the Three-Dimensional Structure of the Enzyme
Notice bibliographique
Résumé
Human estrogenic 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase is an NADP(H)-preferring enzyme. It possesses 11- and 4-fold higher specificity toward NADP(H) over NAD(H) for oxidation and reduction, respectively, as demonstrated by kinetic studies. To elucidate the roles of the amino acids involved in cofactor specificity, we generated variants by site-directed mutagenesis. The results showed that introducing a positively charged residue, lysine, at the Ser12 position increased the enzyme's preference for NADP(H) more than 20-fold. Substitution of the negatively charged residue, aspartic acid, into the Leu36 position switched the enzyme's cofactor preference from NADPH to NAD with a 220-fold change in the ratio of the specificity toward the two cofactors in the case of oxidation. This variant dramatically abolished the enzyme's reductase function and stimulated its dehydrogenase activity, as shown by enzyme activity in intact cells. The substrate-binding pocket was also studied with four variants: Ser142Gly, Ser142Cys, His221Ala, and Glu282Ala. The Ser142Gly variant abolished most of the enzyme's oxidation and reduction activities. The residual reductase activity in vitro is less than 2% that of the wild-type enzyme. However, the Ser142Cys variant was fully inactive, both as a partially purified protein and in intact cells. This suggests that the bulky sulfhydryl group of cysteine entirely disrupted the catalytic triad and that the Ser142 side chain is important for maintaining the integrity of this triad. His221 variation weakened the apparent affinity for estrone, as demonstrated by a 30-fold increase in Michaelis-Menten constant, supporting its important role in substrate binding. This residue may play an important role in substrate inhibition via the formation of a dead-end complex. The formerly suggested importance of Glu282 could not be confirmed.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».