Epitope mapping in cell surface proteins by site-directed masking: defining the structural elements of NTPDase3 inhibition by a monoclonal antibody
Notice bibliographique
Résumé
We adapted the method of epitope mapping by site-directed masking, which was described for purified soluble antigens [Paus,D. and Winter,G. (2006) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 103, 9172-9177.], to map the binding site of an inhibitory monoclonal antibody on the cell surface protein ecto-nucleotidase NTPDase3. Using homology modeling, we built a 3D structure of NTPDase3 and designed 21 single cysteine mutations distributed over the surface of the enzyme. The mutant proteins were expressed in cells, biotinylated with a cysteine-specific reagent, and then extracted with detergent and immobilized on streptavidin-coated plates. Tethering NTPDase3 via cysteine residues located in a surface patch near the active site cleft masked the epitope and blocked antibody binding, as evaluated by enzyme inhibition assay and by ELISA. We then constructed 18 single alanine substitution mutations within the defined patch and found that W403A, D414A, E415A and R419A decreased the inhibitory effect of the antibody, whereas the double mutation W403A/R419A abolished both antibody binding and enzyme inhibition, suggesting the critical role of these residues for interaction with the antibody. Lack of competition between the antibody and a non-hydrolyzable substrate analog AMPPCP, as well as location of the epitope adjacent to the active site, suggest a noncompetitive mechanism of inhibition by steric hindrance. The described technique should be useful for systematic epitope mapping in cell membrane proteins for which either a 3D structure is available, or a sufficiently accurate 3D model can be obtained by homology modeling.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».