A169 FLUORESCENT LABELING OF THE HCV HELICASE TO MONITOR NUCLEIC ACID UNWINDING BY FRET
Notice bibliographique
Résumé
The hepatitis C virus (HCV) non-structural protein 3 (NS3) contains a helicase activity essential for viral replication. The helicase binds to single-stranded (ss) regions of nucleic acids and unwinds duplexes in an ATP-dependent manner. The mechanism by which the helicase disrupts RNA secondary structure in the viral genome to make way for the replication machinery remains elusive. Several mechanisms have been proposed, which include an active mechanism whereby the helicase actively engages the ss/double-stranded (ds) junction of the substrate to unwind the duplex, and a passive mechanism where the helicase binds and translocates along a ss nucleic acid overhang, taking advantage of transient melting at the ss/ds junction. To generate site-specific fluorescently labeled HCV helicase as a tool to track the movement of the enzyme during unwinding and monitor the dynamics of this process. The unnatural amino acid p-azido phenylalanine was incorporated in the recombinant HCV helicase during protein expression in E. coli. Using a strain-promoted azide-alkyne click reaction we developed a one-step process to screen for both protein expression and reactivity of the azido group from the incorporated unnatural amino acid. After successfully identifying a position in the helicase for incorporation of the unnatural amino acid and fluorescent labeling with a Cy5 fluorophore, we used the site-specific fluorescently labeled enzyme to monitor the location of binding by Förster Resonance Energy Transfer (FRET) to DNA substrates modified with an appropriate Cy3 donor fluorophore. Using our approach to simultaneously screen for protein expression with the unnatural amino acid as well as reactivity of the incorporated unnatural amino acid, we identified a position in the HCV helicase suitable for incorporation of p-azido phenylalanine and fluorescent labeling with a Cy5 fluorescent dye. We then developed a plate-based FRET assay to confirm that we could detect the location of binding on a DNA substrate in a distance-dependent manner. Finally, using single molecule fluorescence microscopy we were able to detect binding by FRET for individual enzyme-substrate complexes. The FRET-based assay has the potential to monitor distinct steps of the unwinding process. Single molecule FRET experiments will provide a deeper understanding of the mechanism by which the helicase interacts with its substrate during unwinding and the dynamics involved in this process. CIHRthe Canadian Network on Hepatitis C (CanHepC), and the Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS)
Récupéré en direct depuis OpenAlex et désinversé. Les résumés ne sont pas conservés dans cette base de données : les index inversés représentent 8,6 Go des 9,3 Go de texte de la base, et le serveur dispose de 13 Go libres.
Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».