Real-time tracking of complex ubiquitination cascades using a fluorescent confocal on-bead assay
Notice bibliographique
Résumé
BACKGROUND: The ubiquitin-proteasome system (UPS) controls the stability, localization and/or activity of the proteome. However, the identification and characterization of complex individual ubiquitination cascades and their modulators remains a challenge. Here, we report a broadly applicable, multiplexed, miniaturized on-bead technique for real-time monitoring of various ubiquitination-related enzymatic activities. The assay, termed UPS-confocal fluorescence nanoscanning (UPS-CONA), employs a substrate of interest immobilized on a micro-bead and a fluorescently labeled ubiquitin which, upon enzymatic conjugation to the substrate, is quantitatively detected on the bead periphery by confocal imaging. RESULTS: UPS-CONA is suitable for studying individual enzymatic activities, including various E1, E2, and HECT-type E3 enzymes, and for monitoring multi-step reactions within ubiquitination cascades in a single experimental compartment. We demonstrate the power of the UPS-CONA technique by simultaneously following ubiquitin transfer from Ube1 through Ube2L3 to E6AP. We applied this multi-step setup to investigate the selectivity of five ubiquitination inhibitors reportedly targeting different classes of ubiquitination enzymes. Using UPS-CONA, we have identified a new activity of a small molecule E2 inhibitor, BAY 11-7082, and of a HECT E3 inhibitor, heclin, towards the Ube1 enzyme. CONCLUSIONS: As a sensitive, quantitative, flexible, and reagent-efficient method with a straightforward protocol, UPS-CONA constitutes a powerful tool for interrogation of ubiquitination-related enzymatic pathways and their chemical modulators, and is readily scalable for large experiments.
Récupéré en direct depuis OpenAlex et désinversé. Les résumés ne sont pas conservés dans cette base de données : les index inversés représentent 8,6 Go des 9,3 Go de texte de la base, et le serveur dispose de 13 Go libres.
Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».