High-yield production of human Dicer by transfection of human HEK293-EBNA1 cells grown in suspension
Notice bibliographique
Résumé
Dicer is a 219-kDa protein that plays key roles in gene regulation, particularly as the ribonuclease III enzyme responsible for cleaving precursor miRNA substrates. Its enzymatic activity is highly regulated by protein factors, and this regulation can impact on the levels of miRNAs and modulate the behavior of a cell. To better understand the underlying mechanisms of regulation, detailed enzymatic and structural characterization of Dicer are needed. However, these types of studies generally require several milligrams of recombinant protein, and efficient preparation of such quantities of pure human Dicer remains a challenge. To prepare large quantities of human Dicer, we have optimized transfection in HEK293-6E cells grown in suspension and streamlined a purification procedure. Transfection conditions were first optimized to achieve expression levels between 10 and 18 mg of recombinant Dicer per liter of culture. A three-step purification protocol was then developed that yields 4–9 mg of purified Dicer per liter of culture in a single day. From SEC-MALS/RI analysis and negative stain TEM, we confirmed that the purified protein is monomerically pure ( ≥ 98%) and folds with the characteristic L-shape geometry. Using an electrophoretic mobility shift assay, a dissociation constant (Kd) of 5 nM was measured for Dicer binding to pre-let-7a-1, in agreement with previous reports. However, when probing the cleavage activity of Dicer for pre-let-7a-1, we measured kcat (7.2 ± 0.5 min− 1) and KM (1.2 ± 0.3 μM) values that are much higher than previously reported due to experimental conditions that better respect the steady-state assumption. The expression and purification protocols described here provide high yields of monomerically pure and active human Dicer. Cleavage studies of a pre-let-7 substrate with this purified Dicer reveal higher kcat and KM values than previously reported and support the current view that conformational changes are associated with substrate binding. Large quantities of highly pure Dicer will be valuable for future biochemical, biophysical and structural investigations of this key protein of the miRNA pathway.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».