Improving sensitivity of single tube nested PCR to detect fastidious microorganisms
Notice bibliographique
Résumé
Single Tube Nested PCR (ST-nPCR) is of value to clinical laboratories with limited settings for the detection of fastidious microorganisms. The detection sensitivity of ST-nPCR is dependent on ensuring minimal leftovers of outer primers during the second round of the reaction. In this work, we investigated various approaches to optimize the performance of outer primers, including decreasing outer primer concentrations; using antisense oligonucleotides to block outer primers; using chemically modified inner primers; and using Q5 Taq polymerase that lacks 5′-3′ exonuclease and strand displacement capabilities. These solutions were tested on C. abortus and C. psittaci , which are both fastidious intracellular bacteria that are difficult to diagnose. The best obtained result was by using Q5 Taq polymerase. A detection limit with a range between 0.1 and 1 ag was achieved, which corresponds to a range between 0.2 and 2 copies of the plasmid positive control. This level of sensitivity is comparable or even better than the sensitivity achieved by TaqMan probe based real-time PCR assays. The assay was validated using 70 veterinary clinical samples from small ruminant abortions and 10% of these samples gave positive results. In conclusion, sensitivity of ST-nPCR to detect fastidious microorganisms can be improved by using Taq polymerases that lacks 5′-3′ exonuclease. The proposed assay is affordable and applicable to a wide range of fastidious pathogens and can be suitable for laboratories with limited settings.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,003 | 0,004 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,002 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,001 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,002 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».