Mass spectrometric analysis of core fucosylation and sequence variation in a human–camelid monoclonal antibody
Notice bibliographique
Résumé
Electrospray mass spectrometry (ESI-MS) was used to measure the masses of an intact dimeric monoclonal antibody (Mab) and assess the fucosylation level. The Mab under study was EG2-hFc, a chimeric human-camelid antibody of about 80 kDa (A. Bell et al., Cancer Lett., 2010, 289(1), 81-90). It was obtained from cell culture with and without a fucosylation inhibitor, and treated with EndoS which cleaves between the two core N-acetyl glucosamine (GlcNAc) residues. It is the first time that this combined approach with a unique mass spectrometer was used to measure 146 Da differences as part of a large intact dimeric antibody. Results showed that in the dimer, both heavy chains were fucosylated on the core GlcNAc of the Fc Asn site equivalent to Asn297. In the presence of the fucosylation inhibitor, fucosylation was lost on both subunits. Following reduction, monomers were analyzed and the masses obtained corroborated the dimer results. Dimeric EG2-hFc Mab treated with PNGase F, to deglycosylate the protein, was also measured by MS for mass comparison. In spite of the success of fucosylation level measurements, the experimental masses of deglycosylated dimers and GlcNAc-Fuc bearing dimers did not correspond to masses of our sequence of reference (A. Bell et al., Cancer Lett., 2010, 289(1), 81-90; ; ), which prompted experiments to determine the protein backbone sequence. Digest mixtures from trypsin, GluC, as well as trypsin + GluC proteolysis were analyzed by matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS and MS/MS. A few variations were found relative to the reference sequence, which are discussed in detail herein. These measurements allowed us to build a new "experimental" sequence for the EG2-hFc samples investigated in this work, although there are still ambiguities to be resolved in this new sequence. MALDI-MS/MS also confirmed the fucosylation pattern in the Fc tryptic peptide EEQYNSTYR.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».