Expression and purification of active protein kinase Cd (PKCd) kinase domain from E. coli
Notice bibliographique
Résumé
PKC isozymes can be divided into three subfamilies based on structural and enzymatic differences: conventional, novel and atypical. PKCδ is a member of the subfamily of novel PKC's. In an effort to obtain X‐ray crystal structure of this nPKC family target, we expressed and purified a recombinant PKCδ kinase domain construct in E. coli. Here we show that the recombinant kinase domain has activity, is monomeric by size‐exclusion chromatography (SEC), and can auto‐phosphorylate heterogeneously within the cell during expression. PKCδ kinase domain (317–676) was expressed in BL21 cells with a C‐terminal 6‐His tag, and purified +/− ATP to >95% following a four‐step protocol. The purified product eluted as a single, monomeric peak during SEC. Multiple phosphorylations (avg 5–7) were observed by ESI‐MS for both of the +/− ATP preparations; indicating that all phosporylation events most likely occur during expression. In addition, both +/− ATP preparations displayed substrate inhibition with the PKC‐specific FARK inhibitor peptide, while NMR saturation transfer difference (STD) binding experiments showed that AMP‐PNP binds and competes with bisindolylmaleimide for the same active site of PKCδ (317–676). Although, the construct proved difficult to crystallize, we have successfully produced a method for purification of a PKCδ kinase domain from E. coli suitable for assay development, and selectivity studies with other nPKC family members.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».