Identification of R-loop-forming Sequences in Drosophila melanogaster Embryos and Tissue Culture Cells Using DRIP-seq

R-loops are non-canonical nucleic structures composed of an RNA–DNA hybrid and a displaced ssDNA. Originally identified as a source of genomic instability, R-loops have been shown over the last decade to be involved in the targeting of proteins and to be associated with different histone modifications, suggesting a regulatory function. In addition, R-loops have been demonstrated to form differentially during the development of different tissues in plants and to be associated with diseases in mammals. Here, we provide a single-strand DRIP-seq protocol to identify R-loop-forming sequences in Drosophila melanogaster embryos and tissue culture cells. This protocol differs from earlier DRIP protocols in the fragmentation step. Sonication, unlike restriction enzymes, generates a homogeneous and highly reproducible nucleic acid fragment pool. In addition, it allows the use of this protocol in any organism with minimal optimization. This protocol integrates several steps from published protocols to identify R-loop-forming sequences with high stringency, suitable for de novo characterization.Graphic abstract:Figure 1. Overview of the strand-specific DRIP-seq protocol, [摘要]R-环是由RNA-DNA杂交和取代的单链DNA组成的非标准核酸结构。最初被认为是基因组不稳定性的一个来源，在过去的十年中，R-环被证明参与了蛋白质的靶向性，并与不同的组蛋白修饰相关，表明其具有调节功能。此外，R-环在植物不同组织发育过程中形成差异，并与哺乳动物疾病有关。在这里，我们提供了一个单链drop-seq方法来鉴定果蝇胚胎和组织培养细胞中的R-环形成序列。此协议在分段步骤中不同于早期的滴滴协议。与限制性内切酶不同的是，超声作用产生了一个均匀的、高度可重复的核酸片段库。此外，它允许在任何有机体中以最小的优化使用该协议。该协议集成了几个步骤，从已发表的协议，以确定R-环形成序列具有高严格性，适合从头表征。 图形摘要： 图1。链特定的drop-seq协议概述 【背景】概述R环是RNA与互补单链DNA杂交时形成的三链核酸结构，导致第二条DNA链的位移。R环最初被描述为转录的副产物和需要解决的基因组不稳定性的来源。然而，过去十年的研究表明，R-环可与特定组蛋白修饰和转录状态相关，诱导蛋白质靶向，或作为启动子（Chedin和Benham，2020；尼赫斯和卢克，2020）。为了研究R-环功能，已经开发了在多种生物中绘制这些结构的协议。物种间的差异已被观察到：哺乳动物的Rloop形成序列具有GC偏斜；那些在酿酒酵母有一个在倾斜；在植物中，GC和AT偏斜都有报道（Sanz等人，2016；Wahba等人，2016年；徐等，2017；Hartono等人，2018年）。物种间R-loop形成序列的性质和定位的差异以及R-loop与不同疾病和基因错误表达的关联，突出了开发标准R-loop作图协议以进行严格比较的重要性。植物中的R-环图谱表明，一些R-环在发育过程中可以形成差异（Fang等人，2019年；Xu等人，2020），可能参与转录状态的改变。在哺乳动物中，活性增强子与R-环的形成有关，这些R-环可以作为启动子（Tan Wong等人，2019）。利用现有的遗传工具，在完整生物体发育的背景下研究R环，以评估其形成、分辨率和功能，将有助于更好地理解R环生物学。在这里，我们提供了一个详细的链特异性drop-seq方案，用于识别果蝇胚胎和组织培养细胞中的R-环形成序列（图1）。与其他滴灌方案类似，我们的方案依赖S9.6抗体来识别R-环形成序列，但也认为S9.6抗体对dsRNA的弱亲和力会产生假阳性信号（Phillips等人，2013；Hartono等人，2018年；K公司ö尼格等人，2017年）。这种单链drop-seq方案与可用于果蝇的遗传工具相结合，应该是研究整个有机体、发育过程中以及不同组织中R-loop功能的强大系统（图2，表1）。DRIPseq可以与基因操作相结合来过度表达或敲除基因，以确定它们对R-环形成的影响，或者与细胞同步来跟踪细胞周期中R-环的形成。最后，使用超声波而不是限制性内切酶来切割基因组DNA意味着这一方案可能以最小的优化适应其他生物体。 局限性该方案依赖于S9.6抗体来免疫沉淀RNA-DNA杂交包含片段。这种抗体并不是一个完美的工具：它显示了基于Rloop序列的差异结合亲和力，与GC含量无关，并且偏好较长的RNA-DNA杂交。它可以结合dsRNA，尽管其亲和力比RNA-DNA杂交的亲和力低5倍（Phillips等人，2013；K公司ö尼格等人，2017年）。后两个限制可以在制备核酸的过程中克服。核酸提取后，通过在0.5 M NaCl存在下将核酸与RNase A孵育来去除ssRNA和dsRNA，以避免RNA-DNA杂交中的RNA降解。第一个消化步骤之后是与RNase III孵育，以降解任何未被RNase A降解的dsRNA。通过在免疫沉淀前使用两种不同的核糖核酸酶，我们去除了所有的ssRNA和dsRNA，还去除了一些可能对这些核糖核酸酶敏感的R-环。因此，这些步骤使实验更加严格，并限制假阳性，但可以进行修改，以平衡严格性和敏感性，因为一些R-环可能对这些治疗敏感。当R-环的RNA组分被测序时，去除能与S9.6相互作用的RNA是最相关的；尽管如此，我们观察到当使用严格的核糖核酸酶处理时，RNA-DNA杂交的下拉效率会增加。同样重要的是要有一个RNase H处理的阴性对照来评估下拉的特异性（图3）。我们发现市面上可以买到的E。大肠杆菌核糖核酸酶H不能完全消化核酸制剂中的RNA-DNA杂交。这可以通过生产和使用高活性的人核糖核酸酶H1和核糖核酸酶H2来解决。这种负控制在滴灌协议的优化过程中尤为重要；它确保了技术的特殊性。它还用于在执行drop seq时调用peaks（图2、4和5）。为了避免在免疫沉淀步骤中偏向较长的片段，我们通过超声波将核酸片段化（图4A）。超声处理使我们能够获得平均大小为300 bp的同质碎片群。超声波是在核糖核酸酶A处理后进行的，以避免在滴注过程中产生新的RNA-DNA杂交体的可能性。据报道，与限制性消化相比，超声波处理会降低一些RNA-DNA杂交的回收率（Crossley等人，2020）。 优势与其他滴灌协议相比的优势该方案使用温和的裂解步骤提取核酸。细胞裂解可以在组织培养细胞、整个胚胎或来自幼虫、蛹或成体果蝇的解剖组织上进行。尽管进行一次滴灌seq实验所需的约200mg果蝇胚胎相对较高，但冷冻组织并将其汇集用于单个核酸提取的可能性使其成为可能。通过解剖黑腹果蝇并对盘、器官或分类细胞群进行滴注，应该有可能识别细胞或组织特异性R环。与针对哺乳动物细胞开发的几种方案（例如，Sanz等人，2016年）相反，这种滴注方案不使用限制性酶混合物来分割核酸。相反，使用超声波，这导致平均大小为300 bp的核酸碎裂（图4A）。这些碎片具有均匀的大小和超声波是高度可重复性。与限制性消化相比，在哺乳动物细胞中使用超声波可提高分辨率（Crossley et al.，2020）。通过使用超声波，该协议可以很容易地适应其他生物与小优化；唯一可能需要优化的步骤是分解。超声波还有另一个优势：它会导致R环移位的单链DNA断裂，这使得使用RNA-DNA杂交的DNA或RNA部分制备链特异性测序文库成为可能（Wahba et al.，2016）。 与其他方法相比的优点另一种识别R-环形成序列的方法依赖于RNase H1酶（dRNase H1）的催化非活性形式（Ginno等人，2012；陈等人，2017）。dRNase H1在细胞中的应用提出了几个潜在的问题，这可能解释了该方法与S9.6抗体在识别R-环形成序列方面的差异。首先，RNase H1不是细胞中Rloops的唯一调节因子；有人认为拓扑异构酶是负责在人类细胞中形成共转录R-环的主要酶（Manzo等人，2018；张等。，而核糖核酸酶H1和H2在R环形成后就以它们为靶点。其次，Lockhart et al.，2019最近的一篇文章证明，RNase H1在应激时被激活，而RNase H2在S。酿酒酵母。第三，利用dRNase H1，R-环的鉴定可能局限于R-环，R-环是可接近的，无蛋白质的，并且通常被RNase H酶降解。第四，dRNase H1的表达可以稳定R环。虽然这可能允许检测瞬态R-环，但也可能会扭曲对稳定R-环存在的位置的解释。最后，RNase H1有两个RNA–DNA杂交结合域，两者都需要结合以诱导杂交RNA部分的降解（Nowotny et al.，2008）。这可能会阻止或限制检测到较小的RNA-DNA杂交。因此，虽然dRNase H1在某些情况下可能是一个有用的工具，但对滴灌结果的解释可能更直接。比较两种方法的结果也可以得到互补信息。与滴灌法相似，从组织培养细胞中提取核酸后，用dRNase H1分离RNA-DNA杂交体；然而，与S9.6抗体相比，这种酶倾向于较长的杂交体，并且其亲和力较弱，使得其效率较低（Ginno等人，2012年）。最后，天然亚硫酸氢盐测序是识别R-环的另一种高分辨率方法。亚硫酸氢盐将单链DNA中的胞嘧啶转化为尿嘧啶（Yu等人，2003年）；因此，这种方法不检测RNA-DNA杂交，而是检测它们形成时移位的单链DNA链。然而，甲基胞嘧啶在基因组中的存在阻止了单链DNA的修饰，并且单链DNA可以被其他非规范DNA结构如G-四链体和I-基序的形成所取代，这可能分别导致假阴性或假阳性结果。本文提出的单链drop-seq方法已经被优化，可以在果蝇胚胎和组织培养细胞中识别R-环形成序列，并且可以在其他生物中使用最小的优化。该方案可以作为一种标准化的方法来评估不同发育阶段或不同组织或生物体中的Rloops。 图2。S2细胞和早期和晚期胚胎之间共享和不同R环的例子。A-B。R环在S2细胞和2-6小时和10-14小时胚胎的CG1513、CG3008和CG6040基因上形成（红色箭头）。在CG12923基因上没有形成R环。C。在alt基因上，2-6h可检测到3个R环，而10-14h胚胎中未检测到。其中两个R-环（红色箭头）也存在于S2细胞中，而其中一个被相反链上的R-环所取代（紫色箭头）。D。在Spn1上形成的R环只存在于2-6小时的胚胎中（紫色箭头）。E。Rloops在2-6h胚胎的+链上形成，在10-14h胚胎的-链上形成S2细胞。”Unstr”对应于非标drop-seq数据，“+”和“-”表示链特异性轨道，RNase H处理的样品作为阴性对照。红色箭头表示转录本的方向。请注意，“+”和“-”链指的是DNA链，因此“+”链R-环应该从向左方向的转录中产生。因此，在A中，CG3008基因中的R-环在预期的方向上来自于基因转录，而CG1513基因中的R-环则来自于反义转录。 表1。数据可用性 存放的数据（摘自Alecki等人，2020） 滴水序列2-6H俄勒冈州R胚胎GSE127329 滴水序列10-14H俄勒冈州R胚胎GSE127329 滴水序列S2电池GSE127329

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