Zebrafish Cre/ <i>lox</i> regulated UFlip alleles generated by CRISPR/Cas targeted integration provide cell-type specific conditional gene inactivation
Notice bibliographique
Résumé
Abstract The ability to regulate gene activity spatially and temporally is essential to investigate cell type specific gene function during development and in postembryonic processes and disease models. The Cre/ lox system has been widely used for performing cell and tissue-specific conditional analysis of gene function in zebrafish, but simple and efficient methods for isolation of stable, Cre/ lox regulated alleles are lacking. Here we applied our GeneWeld CRISPR/Cas9 short homology-directed targeted integration strategy to generate floxed conditional alleles that provide robust gene knockdown and strong loss of function phenotypes. A universal targeting vector, UFlip, with sites for cloning short 24-48 bp homology arms flanking a floxed mRFP gene trap plus secondary reporter cassette, was integrated into an intron in hdac1, rbbp4 , and rb1 . Active, gene off orientation hdac1-UFlip-Off and rb1-UFlip-Off integration alleles result in >99% reduction of gene expression in homozygotes and recapitulate known indel loss of function phenotypes. Passive, gene on orientation rbbp4-UFlip-On and rb1-UFlip-On integration alleles do not cause phenotypes in trans-heterozygous combination with an indel mutation. Cre recombinase injection leads to recombination at alternating pairs of loxP and lox2272 sites, inverting and locking the cassette into the active, gene off orientation, and the expected mutant phenotypes. In combination with our endogenous neural progenitor Cre drivers we demonstrate rbbp4-UFlip-On and rb1-UFlip-On gene inactivation phenotypes can be restricted to specific neural cell populations. Replacement of the UFlip mRFP primary reporter gene trap with a 2A-RFP in rbbp4-UFlip-Off , or 2A-KalTA4 in rb1-UFlip-Off , shows strong RFP expression in wild type or UAS:RFP injected embryos, respectively. Together these results validate a simplified approach for efficient isolation of highly mutagenic Cre/ lox responsive conditional gene alleles to advance zebrafish Cre recombinase genetics.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,007 | 0,003 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».