Heat treatment of thioredoxin fusions increases the purity of α‐helical transmembrane protein constructs
Notice bibliographique
Résumé
Membrane proteins play key roles in cellular signaling and transport, represent the majority of drug targets, and are implicated in many diseases. Their relevance renders them important subjects for structural, biophysical, and functional investigations. However, obtaining membrane proteins in high purities is often challenging with conventional purification steps alone. To address this issue, we present here an approach to increase the purity of α-helical transmembrane proteins. Our approach exploits the Thioredoxin (Trx) tag system, which is able to confer some of its favorable properties, such as high solubility and thermostability, to its fusion partners. Using Trx fusions of transmembrane helical hairpin constructs derived from the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and a bacterial ATP synthase, we establish conditions for the successful implementation of the selective heat treatment procedure to increase sample purity. We further examine systematically its efficacy with respect to different incubation times and temperatures using quantitative gel electrophoresis. We find that minute-timescale heat treatment of Trx-tagged fusion constructs with temperatures ranging from 50 to 90°C increases the purity of the membrane protein samples from ~60 to 98% even after affinity purification. We show that this single-step approach is even applicable in cases where regular selective heat purification from crude extracts, as reported for Trx fusions to soluble proteins, fails. Overall, our approach is easy to integrate into existing purification strategies and provides a facile route for increasing the purity of membrane protein constructs after purification by standard chromatography approaches.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,001 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».