Multiplex Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Assay for Rapid Molecular Detection of Pathogens in Patients With Sepsis: Protocol for an Assay Development Study
Notice bibliographique
Résumé
BACKGROUND: Blood cultures are the cornerstone of diagnosis for detecting the presence of bacteria or fungi in the blood, with an average detection time of 48 hours and failure to detect a pathogen occurring in approximately 50% of patients with sepsis. Rapid diagnosis would facilitate earlier treatment and/or an earlier switch to narrow-spectrum antibiotics. OBJECTIVE: The aim of this study is to develop and implement a multiplex droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) assay as a routine diagnostic tool in the detection and identification of pathogens from whole blood and/or blood culture after 3 hours of incubation. METHODS: The study consists of three phases: (1) design of primer-probe pairs for accurate and reliable quantification of the most common sepsis-causing microorganisms using a multiplex reaction, (2) determination of the analytical sensitivity and specificity of the multiplex ddPCR assay, and (3) a clinical study in patients with sepsis using the assay. The QX200 Droplet Digital PCR System will be used for the detection of the following species-specific genes in blood from patients with sepsis: coa (staphylocoagulase) in Staphylococcus aureus, cpsA (capsular polysaccharide) in Streptococcus pneumoniae, uidA (beta-D-glucuronidase) in Escherichia coli, oprL (peptidoglycan-associated lipoprotein) in Pseudomonas aeruginosa, and the highly conserved regions of the 16S rRNA gene for Gram-positive and Gram-negative bacteria. All data will be analyzed using QuantaSoft Analysis Pro Software. RESULTS: In phase 1, to determine the optimal annealing temperature for the designed primer-probe pairs, results from a gradient temperature experiment will be collected and the limit of detection (LOD) of the assay will be determined. In phase 2, results for the analytical sensitivity and specificity of the assay will be obtained after an optimization of the extraction and purification method in spiked blood. In phase 3, clinical sensitivity and specificity as compared to the standard blood culture technique will be determined using 301 clinical samples. CONCLUSIONS: Successful design of primer-probe pairs in the first phase and subsequent optimization and determination of the LOD will allow progression to phase 3 to compare the novel method with existing blood culture methods. INTERNATIONAL REGISTERED REPORT IDENTIFIER (IRRID): PRR1-10.2196/33746.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,018 | 0,011 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,004 | 0,003 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,002 | 0,002 |
| Bibliométrie | 0,003 | 0,002 |
| Études des sciences et des technologies | 0,002 | 0,002 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,003 | 0,002 |
| Intégrité de la recherche | 0,003 | 0,002 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,033 | 0,019 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».