Strong expression of Cas9 under a new 3′-truncated TEF1α promoter enhances genome editing in Yarrowia lipolytica
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Notice bibliographique
Résumé
The non-conventional yeast Yarrowia lipolytica is gaining interest in biotechnology as a workhorse for the production of proteins, lipids and other biomolecules. Site-specific genome editing is however limited in this yeast. This was much improved by the recent adaptation of a CRISPR-Cas9 genome editing protocol for Y. lipolytica based on a tRNA-sgRNA fusion. Nonetheless, in the latter protocol, Cas9 is under the control of a synthetic hybrid promoter, pUAS1B8-TEF(136) that although reported as strong, yet its tandem repeats might be associated with in vivo and in vitro inconveniences like polymerase slippage, random genetic rearrangements and cloning difficulties. Here we report an optimized synthetic TEF promoter to drive Cas9 expression, pTEF(-41-406)-Kozak, which is a rationally 3’-truncated version of the already known 5’-truncated pTEF(406) promoter of Y. lipolytica fused to a synthetic Kozak sequence. Our comparison of the promoters’ strength using hrGFP reporters and RT-qPCR revealed that the synthetic pTEF(-41-406)-Kozak maintains the same expression strength as that of pTEF(406), which is at least 5-folds higher than that of synthetic pUAS1B8-TEF(136). This pTEF(-41-406)-mediated high expression of Cas9 was not associated with any growth defects. Moreover, Cas9 under pTEF(-41-406)-Kozak increased genome editing efficiencies by 40 % relative to that under pUAS1B8-TEF(136), and this was further concordant by observation of rates of phenotypic losses resulting from pTEF(-41-406)-Kozak-Cas9-mediated gene deletions. This is the first study conducting rational 3’-truncation in TEF promoter in Y. lipolytica based on in silico analysis of promoter sequence and structure, which can be extended to the engineering of other yeast promoters to generate small-sized synthetic biology parts for convenient engineering of biological systems. Here, we provide a strong Cas9 expression cassette for a more convenient and efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Y. lipolytica which will allow harnessing the full potential of this industrial strain.
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Prédiction distillée sur la base complète
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Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
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