Strong expression of Cas9 under a new 3′-truncated TEF1α promoter enhances genome editing in Yarrowia lipolytica
Notice bibliographique
Résumé
The non-conventional yeast Yarrowia lipolytica is gaining interest in biotechnology as a workhorse for the production of proteins, lipids and other biomolecules. Site-specific genome editing is however limited in this yeast. This was much improved by the recent adaptation of a CRISPR-Cas9 genome editing protocol for Y. lipolytica based on a tRNA-sgRNA fusion. Nonetheless, in the latter protocol, Cas9 is under the control of a synthetic hybrid promoter, pUAS1B8-TEF(136) that although reported as strong, yet its tandem repeats might be associated with in vivo and in vitro inconveniences like polymerase slippage, random genetic rearrangements and cloning difficulties. Here we report an optimized synthetic TEF promoter to drive Cas9 expression, pTEF(-41-406)-Kozak, which is a rationally 3’-truncated version of the already known 5’-truncated pTEF(406) promoter of Y. lipolytica fused to a synthetic Kozak sequence. Our comparison of the promoters’ strength using hrGFP reporters and RT-qPCR revealed that the synthetic pTEF(-41-406)-Kozak maintains the same expression strength as that of pTEF(406), which is at least 5-folds higher than that of synthetic pUAS1B8-TEF(136). This pTEF(-41-406)-mediated high expression of Cas9 was not associated with any growth defects. Moreover, Cas9 under pTEF(-41-406)-Kozak increased genome editing efficiencies by 40 % relative to that under pUAS1B8-TEF(136), and this was further concordant by observation of rates of phenotypic losses resulting from pTEF(-41-406)-Kozak-Cas9-mediated gene deletions. This is the first study conducting rational 3’-truncation in TEF promoter in Y. lipolytica based on in silico analysis of promoter sequence and structure, which can be extended to the engineering of other yeast promoters to generate small-sized synthetic biology parts for convenient engineering of biological systems. Here, we provide a strong Cas9 expression cassette for a more convenient and efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Y. lipolytica which will allow harnessing the full potential of this industrial strain.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».