Real-time PCR primers and probes for the detection of Shiga toxin genes, including novel subtypes
Notice bibliographique
Résumé
Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) are foodborne enteric pathogens. STEC are differentiated from other E. coli by detection of Shiga toxin (Stx) or its gene (stx). The established nomenclature of Stx identifies ten subtypes (Stx1a, Stx1c, Stxd, Stx2a to Stx2g). An additional nine subtypes have been reported and described (Stx1e, Stx2h to Stx2o). Many PCR protocols only detect a subset of Stx subtypes which limits their inclusivity. Here we describe a real-time PCR assay inclusive of the DNA sequences of representatives of all currently described Stx subtypes. A multiplex real-time PCR assay for detection of stx was developed using nine primers and four probes. Since the identification of STEC does not require differentiation of stx subtypes, the probes use the same fluorescent reporter to enable detection of multiple possible targets in a single reaction. The PCR mixture includes an internal positive control to detect inhibition of the reaction. Thus, the protocol can be performed on a two-channel real-time PCR platform. To reduce the biosafety risk inherent in the use of STEC cultures as process controls, the protocol also includes the option of a non-pathogenic E. coli transformant carrying a plasmid encoding the targeted fragment of the stx2a sequence. The inclusivity of the PCR was assessed against colonies of 137 STEC strains and one strain of Shigella dysenteriae, including strains carrying single copies of stx representing fourteen subtypes (stx1 a, c, d; stx2 a-j and o). Five additional subtypes (stx1e, 2k, 2l, 2m and 2n) were represented by E. coli transformed with plasmids encoding toxoid (enzymatically inactive A subunit) sequences. The exclusivity panel consisted of 70 bacteria, including 21 stx-negative E. coli. Suitability for food analysis was assessed with artificially inoculated ground beef, spinach, cheese, and apple cider. The real-time PCR generated positive results for all 19 stx subtypes, represented by colonies of STEC, S. dysenteriae and E. coli transformants carrying stx toxoid plasmids. Tests of exclusivity panel colonies were all negative. The real-time PCR detected the presence of stx in all inoculated food enrichments tested, and the presence of STEC was confirmed by isolation.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,003 | 0,003 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,004 | 0,002 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,002 | 0,002 |
| Bibliométrie | 0,002 | 0,002 |
| Études des sciences et des technologies | 0,001 | 0,002 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,002 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,002 | 0,005 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,011 | 0,004 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».