Biochemical plasticity of the <i>Escherichia coli</i><scp>CRISPR</scp> Cascade revealed by <i>in vitro</i> reconstitution of Cascade activities from purified Cas proteins
Notice bibliographique
Résumé
The most abundant clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) type I systems employ a multisubunit RNA-protein effector complex (Cascade), with varying protein composition and activity. The Escherichia coli Cascade complex consists of 11 protein subunits and functions as an effector through CRISPR RNA (crRNA) binding, protospacer adjacent motif (PAM)-specific double-stranded DNA targeting, R-loop formation, and Cas3 helicase-nuclease recruitment for target DNA cleavage. Here, we present a biochemical reconstruction of the E. coli Cascade from purified Cas proteins and analyze its activities including crRNA binding, dsDNA targeting, R-loop formation, and Cas3 recruitment. Affinity purification of 6His-tagged Cas7 coexpressed with untagged Cas5 revealed the physical association of these proteins, thus producing the Cas5-Cas7 subcomplex that was able to bind specifically to type I-E crRNA with an efficiency comparable to that of the complete Cascade. The crRNA-loaded Cas5-7 was found to bind specifically to the target dsDNA in a PAM-independent manner, albeit with a lower affinity than the complete Cascade, with both spacer sequence complementarity and repeat handles contributing to the DNA targeting specificity. The crRNA-loaded Cas5-7 targeted the complementary dsDNA with detectable formation of R-loops, which was stimulated by the addition of Cas8 and/or Cas11 acting synergistically. Cascade activity reconstitution using purified Cas5-7 and other Cas proteins showed that Cas8 was essential for specific PAM recognition, whereas the addition of Cas11 was required for Cas3 recruitment and target DNA nicking. Thus, although the core Cas5-7 subcomplex is sufficient for specific crRNA binding and basal DNA targeting, both Cas8 and Cas11 make unique contributions to efficient target recognition and cleavage.
Récupéré en direct depuis OpenAlex et désinversé. Les résumés ne sont pas conservés dans cette base de données : les index inversés représentent 8,6 Go des 9,3 Go de texte de la base, et le serveur dispose de 13 Go libres.
Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».