Anti-CRISPR-mediated continuous directed evolution of CRISPR-Cas9 in human cells
Notice bibliographique
Résumé
ABSTRACT Engineering CRISPR-Cas systems for improved or altered function is central to both research and therapeutic applications. Unfortunately most optimization, especially directed evolution in bacterial hosts, fails to capture the functional requirements of the complex mammalian cellular milieu, where activity is usually required. Robust strategies to enable continuous directed evolution of genome-targeting agents directly in human cells remain lacking. Here, we introduce CRISPR-MACE (Mammalian cell-enabled Adenovirus-assisted Continuous Evolution) as a foundational technology to address this need. CRISPR-MACE integrates virus-based continuous evolution with anti-CRISPR-based tunable selection to generate novel Streptococcus pyogenes Cas9 variants with both increased and decreased DNA binding capacity and nearly 1000-fold–enhanced resistance to AcrIIA4, the strongest known inhibitor of SpCas9. Notably, across independent evolution campaigns the same Cas9 gatekeeper mutation reproducibly emerged first, enabling subsequent adaptive steps along two interdependent axes of Cas9 function. In addition to advancing CRISPR technologies, this work establishes key principles and synthetic circuits for continuously evolving CRISPR-Cas systems directly in human cells. SIGNIFICANCE STATEMENT CRISPR technologies are typically engineered in bacteria, even though they must function in the far more complex environment of human cells. This gap has limited the discovery of variants with improved DNA recognition or with resistance to inhibitors that operate differently in mammalian systems. Here we establish CRISPR-MACE, a continuous evolution platform that leverages pressure from anti-CRISPR proteins to select Cas9 variants directly in human cells that have novel functions. Evolved variants show improvements in DNA binding strength and residence time, as well as striking escape from the potent Cas9 inhibitor AcrIIA4. Many anti-CRISPR proteins use distinct mechanisms, so our strategy can drive future continuous evolution campaigns in mammalian cells that expand the functional properties of genome-targeting agents.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,002 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».