Mechanistic Evaluation of <i>MelA</i> α-Galactosidase from <i>Citrobacter freundii</i>: A Family 4 Glycosyl Hydrolase in Which Oxidation Is Rate-Limiting
Notice bibliographique
Résumé
The <i>MelA</i> gene from <i>Citrobacter freundii</i>, which encodes a glycosyl hydrolase family 4 (GH4) α-galactosidase, has been cloned and expressed in <i>Escherichia coli</i>. The recombinant enzyme catalyzes the hydrolysis of phenyl α-galactosides via a redox elimination–addition mechanism involving oxidation of the hydroxyl group at C-3 and elimination of phenol across the C-1–C-2 bond to give an enzyme-bound glycal intermediate. For optimal activity, the MelA enzyme requires two cofactors, NAD<sup>+</sup> and Mn<sup>2+</sup>, and the addition of a reducing agent, such as mercaptoethanol. To delineate the mechanism of action for this GH4 enzyme, we measured leaving group effects, and the derived β<sub>lg</sub> values on <i>V</i> and <i>V</i>/<i>K</i> are indistinguishable from zero (−0.01 ± 0.02 and 0.02 ± 0.04, respectively). Deuterium kinetic isotope effects (KIEs) were measured for the weakly activated substrate phenyl α-d-galactopyranoside in which isotopic substitution was incorporated at C-1, C-2, or C-3. KIEs of 1.06 ± 0.07, 0.91 ± 0.04, and 1.02 ± 0.06 were measured on <i>V</i> for the 1-<sup>2</sup>H, 2-<sup>2</sup>H, and 3-<sup>2</sup>H isotopic substrates, respectively. The corresponding values on <i>V</i>/<i>K</i> were 1.13 ± 0.07, 1.74 ± 0.06, and 1.74 ± 0.05, respectively. To determine if the KIEs report on a single step or on a virtual transition state, we measured KIEs using doubly deuterated substrates. The measured <sup>D</sup><i>V</i>/<i>K</i> KIEs for MelA-catalyzed hydrolysis of phenyl α-d-galactopyranoside on the dideuterated substrates, <sup>D</sup><i>V</i>/<i>K</i><sub>(3-D)/(2-D,3-D)</sub> and <sup>D</sup><i>V</i>/<i>K</i><sub>(2-D)/(2-D,3-D)</sub>, are 1.71 ± 0.12 and 1.71 ± 0.13, respectively. In addition, the corresponding values on <i>V</i>, <sup>D</sup><i>V</i><sub>(3-D)/(2-D,3-D)</sub> and <sup>D</sup><i>V</i><sub>(2-D)/(2-D,3-D)</sub>, are 0.91 ± 0.06 and 1.01 ± 0.06, respectively. These observations are consistent with oxidation at C-3, which occurs via the transfer of a hydride to the on-board NAD<sup>+</sup>, being concerted with proton removal at C-2 and the fact that this step is the first irreversible step for the MelA α-galactosidase-catalyzed reactions of aryl substrates. In addition, the rate-limiting step for <i>V</i><sub>max</sub> must come after this irreversible step in the reaction mechanism.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,004 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,011 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».