Desarrollo de intrones del grupo II como vectores de reconocimiento génico y su aplicación en genómica funcional en microorganismos y plantas

marcador de resistencia activable por retrohoming y su incorporación a vectores donadores de intrón III.4.DISCUSIÓN CAPÍTULO IV ACTIVIDAD DE RmInt1 EN HOSPEDADORES HETERÓLOGOS BACTERIANOS Y EUCARIOTAS (PLANTAS) IV.1 INTRODUCCIÓN IV.2 MATERIAL Y MÉTODOS IV.2.1.Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento IV.2.2.Construcción de plásmidos IV.2.3.Ensayos de homing in vivo IV.2.4.Localización de las fusiones IEP-GFP IV.3.RESULTADOS 207 IV.3.1.RmInt1 es móvil en E. coli y P. putida.IV.3.2.Construcción de fusiones IEP-GFP para su uso en bacteria IV.3.3.Localización intrabacteriana de las fusiones IEP-GFP IV.3.4Localización subcelular en protoplastos de A. thaliana IV.4.DISCUSIÓN CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA ABREVIATURAS Y ANGLICISMOS AGRADECIMIENTOS INTRODUCCIÓN 4 Se han encontrado intrones del grupo II en Proteobacteria, Cyanobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteriodes y Firmicutes (Gram positiva) (base de datos de intrones del grupo II: http://www.fp.ucalgary.ca/group2introns).5 Sólo un tercio de los intrones del grupo II de orgánulos presentan IEP (Toor et al., 2001) Dominio IIEl DII contiene motivos importantes para el ensamblaje estructural del intrón (Costa et al., 1997b), y puede contener inserciones adicionales de RNA que, en algunos casos, forman ORFs que pueden codificar proteínas.Por ello, el DII puede actuar como una vía potencial de codificación de genes adicionales que son transportados a nuevos lugares del DNA cuando el intrón se retrotranspone, aunque los ORFs en el DII son poco comunes (Simon et al., 2008).El DII forma dos interacciones terciarias esenciales tipo tetraloop-receptor 8 con el DI (-', vista antes) y con el DIV (-') (Chanfreau y Jacquier, 1996; Costa et al., 1997b).La interacción -' se mantiene durante todo el proceso de maduración lo que indica que podría estar implicada en la estabilización de la estructura nativa del intrón (Chanfreau y Jacquier, 1996; Costa et al., 1997b) siendo diferente entre los intrones IIA y IIB.Esta interacción también se considera importante para acercar tanto el DIII como la región entre DII/DIII (J II/III ) 9 al centro catalítico (Ferodova et al., 2003).La interacción con el DIV está estructuralmente conservada entre los intrones IIA y IIB (Costa et al., 1997b).El contacto tetraloop/receptor η-η' se establece entre la región central del DII y el bucle terminal del DVI y se ha propuesto que esta interacción podría actuar como un interruptor conformacional entre los dos pasos del splicing permitiendo la ligación de los exones (Chanfreau y Jacquier, 1996). Dominio IIIEl DIII contiene una región desapareada interna (la región más conservada dentro del DIII) que es importante para el ensamblaje estructural del intrón, formando parte del centro activo (Toor et al. 2010).Actúa como efector catalítico (Qin y Pyle, 1998;Pyle y Lambowitz, 2006).No es imprescindible para la catálisis (Koch et al., 1992), pero su presencia incrementa de forma notable la proporción de intrón escindido y la inserción del intrón (Griffin et al., 1995;Xiang et al., 1998;Fedorova et al., 2003).El DIII une el resto del intrón con alta afinidad relativa (Podar et al. 1995a).Se cree que el tallo basal y la región desapareada interna podrían estar 8 Son contactos que suelen esta implicados en la estabilización de la estructura terciaria mediante puentes de hidrógeno.Hay 2 tipos principales descritos en intrones del grupo II: (i) GNRA/receptor G-C, en el que las posiciones 3 y 4 del tetraloop interaccionan con el surco menor del ARN receptor; y (ii) GAAA/receptor motivo 11 nt (CCUAAG...UAUGG) (Costa y Michel, 1995; 1997).9 La región entre los dominios II Y III (JII/III) es, entre otras, una de las regiones más conservada del intrón, y juega un papel clave en la construcción del sitio activo (Toor et al., 2008a).

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