Identification of Novel Regulators of the Hippo Pathway using Positive Selection Genome Wide CRISPR Screens
Notice bibliographique
Résumé
The Hippo pathway is established as a master regulator of tissue growth and organ size and its dysregulation can lead to cancer. The core pathway consists of the kinases MST1/2 and LATS1/2, their adaptor proteins, SAV1 and MOB1A/1B, respectively, and the transcriptional module YAP and TAZ. Multiple upstream signals such as mechanotransduction, GPCRs and metabolic pathways activate MST1/2 which along with SAV phosphorylates and activates LATS1/2 together with MOB proteins which phosphorylate and sequester YAP/TAZ in the cytoplasm leading to their subsequent degradation. The core pathway is well studied, however, many upstream pathway regulators are ill-defined/unknown. To identify novel Hippo pathway regulators, I undertook two positive selection genome-wide CRISPR screens. I generated clonal cell lines of T24 bladder and MDA-MB-231 breast cancer cells expressing two proteins, Cas9 which enabled gene deletion and a FKBPiCaspase9 fusion protein under YAP/TAZ transcriptional control, which when expressed causes cell death upon addition of chemical dimerizer, AP20187. CRISPR-mediated loss of genes promoting YAP/TAZ activity, allows cell survival by downregulating the FKBPiCaspase9 protein. The first screen, in T24 bladder cancer cells identified the phosphatase adaptor protein PPFIA1 as a positive regulator of YAP/TAZ. I demonstrated that loss of PPFIA1 leads to decreased YAP/TAZ protein levels, increased YAP/TAZ phosphorylation, enhanced cytoplasmic localization and iii decreased YAP/TAZ target gene expression. Immunoprecipitation analysis demonstrated that PPFIA1 interacts with YAP. These data suggest a model in which PPFIA1 plays a role in maintaining YAP in a dephosphorylated state, possibly by recruiting a phosphatase. To identify novel regulators that might be relevant to multiple cell lines I performed a second screen in the MDA-MB-231 cells and identified the Gα protein chaperone RIC8A, which also functions as a Guanine Nucleotide Exchange Factor (GEF), as another putative regulator of the Hippo pathway. I showed that abrogation of RIC8A expression mediated a decrease in total YAP /TAZ protein levels, a decrease in YAP /TAZ target gene expression and increased cytoplasmic localization of YAP/TAZ in both bladder and breast cancer cells. Overall, my thesis introduces a novel method to interrogate the Hippo pathway in multiple cancer types and identifies new regulators of YAP and TAZ.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,003 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».