Toward the Elucidation of the Catalytic Mechanism of the Mono-ADP-Ribosyltransferase Activity of <i>Pseudomonas aeruginosa</i> Exotoxin A
Notice bibliographique
Résumé
The catalytic mechanism for the mono-ADP-ribosyltransferase activity of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A was investigated by steady-state and stopped-flow kinetic analyses. The rate constants for binding of the NAD(+) substrate to the enzyme were found to be 4.7 +/- 0.4 microM(-1) s(-1) and 194 +/- 15 s(-1) for k(on) and k(off), respectively. The k(on) and k(off) rate constants for the eEF-2 substrate binding to the enzyme were 320 +/- 39 microM(-1) s(-1) and 131 +/- 22 s(-1), respectively. A potent, competitive inhibitor against the enzyme, 1,8-naphthalimide, bound the enzyme with k(on) and k(off) rates of 82 +/- 9 microM(-1) s(-1) and 51 +/- 6 s(-1), respectively. Furthermore, the binding on and off rates for the reaction products, ADP-ribose and nicotinamide, were too rapid for detection with the stopped-flow technique. Investigation of the pre-steady-state kinetics for the ADP-ribose transferase activity of the toxin-enzyme showed that there is no pre-steady-state complex formed during the catalytic cycle. Binding of NAD+ and smaller compounds representing the various parts of this substrate were investigated by the fluorescence quenching of the intrinsic toxin fluorescence. The binding data revealed a significant structural change in the enzyme upon NAD+ binding that could not be accounted for on the basis of the sum of the structural changes induced by the various NAD+ constituents. Product inhibition studies were conducted with nicotinamide and eEF-2-ADP-ribose, and the results indicate that the reaction involves a random-order ternary complex mechanism. Detailed kinetic analysis revealed that the eEF-2 substrate shows sigmoidal kinetic behavior with the enzyme, and fluorescence resonance energy transfer measurements indicated that wheat germ eEF-2 is oligomeric in solution.
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Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
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