Optimization Of Stepwise Hematopoietic Differentiation Of Human iPSCs
Notice bibliographique
Résumé
Abstract Since their discovery in 2006, induced pluripotent stem cells (iPSCs) with their ES cell-like self-renewal and differentiation capability, are set to revolutionize the field of regenerative medicine. There is tremendous interest in the field of hematology for derivation of hematopoietic stem cells (HSCs) and hematopoietic progenitors (HPCs) by in vitro differentiation of IPSCs. IPSCs can be differentiated into HSC/HPCs by coculture on feeder cells, such as OP9, or by using stepwise differentiation protocols on defined media. Neither approach produces high yields of HSCs or HPCs. With an intention to improve this, we systematically investigated various parameters for in vitro differentiation of iPSCs into HPCs. iPSCs were derived from human adult dermal fibroblasts by transduction with the Yamanaka retroviral vectors (encoding human Klf4, Oct3/4, Sox2 and cMyc) or by electroporation with the Yamanaka Epstein–Barr virus-based episomal plasmid vectors (encoding Klf4, Oct3/4, Sox2, L-Myc and p53 targeting shRNA). One iPSC clone of each variety was then subjected to a stepwise differentiation protocol described by Niwa and coworkers [PLoSOne. (2011); 6(7):e22261] followed by hematopoietic colony forming (CFU) assays in MethoCult (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada). The original protocol calls for the use of Stemline II serum-free medium (Sigma, St. Louis, MO) supplemented with various growth factors/cytokines. We investigated the use of APEL medium described by Ng and coworkers [Nature Protocols. (2008); 3(5): 768] as a possible substitute for Stemline II. We also tested the effect of varying the number of colonies seeded in 6-well plates and the efficiency of hematopoietic differentiation after seeding iPSCs as single cells. The results, based on the number of hematopoietic colonies obtained in MethoCult following differentiation, showed that the APEL medium (>100 CFU/100,000 cells) was a superior substitute to the Stemline II medium (<10 CFU/100,000). When IPSCs were seeded as single cells, at initial densities of 10, 100 or 1,000 cells/cm2 in the presence of Y-27632 Rock inhibitor, only the cells at starting density higher than 1,000 per cm2survived but did not yield hematopoietic CFUs in MethoCult. When seeded as colony fragments, lower density of seeding in 6-well plates (< 20 colonies/well) was superior to higher density (>50 colonies/well) for obtaining HPCs. Other parameters that can affect differentiation, such as bone-morphopoietic protein (BMP) and O2 concentration, are being investigated. Figure A. Cellular markers detected at different time points of stepwise hematopoietic differentiation. B. CFUs in MethoCult. Disclosures: No relevant conflicts of interest to declare.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,002 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».