High Throughput Screening of Protein Arginine <i>N</i> ‐Methyltransferases – Filter Binding and Phosphor Screening (FBAPS) assay
Notice bibliographique
Résumé
Study Objective We seek to develop a cost‐effective assay to screen protein arginine N‐ methyltransferase (PRMT) enzyme activity in a high throughput manner by combining P81 filter binding with phosphor imaging. Hypothesis A combination of the P81 filter binding assay and phosphor screening (FBAPS) will provide improved throughput for testing inhibitors against PRMTs while eliminating the economic and environmental costs incurred with current PRMT assays. Statement of methods Recombinantly‐expressed PRMT1 and coactivator‐associated arginine methyltransferase 1 (CARM1) were used to develop the FBAPS assay using GST fusions of polyA binding protein 1 (PABP1(437‐488)) and glycine‐ and arginine‐rich (GAR) protein as substrates, respectively, and radiolabelled S ‐adenosyl‐L‐[ methyl ‐ 14 C]‐methionine as cofactor. Methylation reactions were spotted onto P81 filter paper in a dot blot apparatus and radioactive signal was measured both by phosphor imaging and liquid scintillation counting. Kinetic parameters (K M , k cat ) for enzymes and substrates were determined, and IC 50 values were obtained for well‐characterized inhibitors S ‐adenosyl‐L‐homocysteine (SAH), MS023, EPZ020411, and Diamine 12 using FBAPS. Summary of Results FBAPS yielded kinetic parameters with no statistically significant differences to what was obtained using liquid scintillation counting. The IC 50 values obtained by the FBAPS assay for PRMT1 and CARM1 were comparable to values reported in literature. Statement of Conclusions The FBAPS assay is a modification to the P81 filter binding assay with a dot blot apparatus that allows for parallel processing of samples in a multi‐well format, dramatically increasing throughput. Signal detection by phosphor imaging offers a cost effective and quantitative method that can be used to screen several inhibitors simultaneously against PRMT enzymes with high accuracy.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,002 | 0,002 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».