Instability of extrachromosomal DNA transformed into the diatom Phaeodactylum tricornutum
Pourquoi ce travail est dans la base
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Notice bibliographique
Résumé
Phaeodactylum tricornutum has been highly studied for its potential as a platform for metabolic engineering. While the possible applications of extrachromosomal expression via an episome have been investigated, there is still a lack of information concerning its efficacy and limitations. Therefore, we studied the episome expression system in P. tricornutum, aiming to elucidate its limitations regarding heterologous protein production and episome rearrangement events. Our objectives were to screen positive transconjugants by fluorescent signal indicating as a proxy for the production of the proteins of interest that could be used for vanillin synthesis, and to characterize the transconjugants by flow cytometry and whole plasmid sequencing. We designed an episome harboring an expression cassette that consisted of the enhanced green-fluorescent-protein (eGFP) linked by Thosea asigna virus 2A self-cleaving peptide (T2A) to a fusion protein of enoyl-CoA hydratase/aldolase (ech) and feruloyl-CoA synthetase (fcs), both from Streptomyces sp. strain V-1. This construction resulted in a percentage of fluorescent transconjugants lower than 10 % and it presented rearranged episomes in the fluorescent and the non-fluorescent transconjugants. The replacement of the fusion protein ech-fcs in the expression cassette with the fluorescent protein mCherry increased the percentage of eGFP fluorescent transconjugants over 80 % suggesting a toxicity of the ech-fcs gene expression and in turn forcing selection for rearranged episomes. A comparison of flow cytometry results and sequencing analysis demonstrated that a successful transformation with an unaltered expression cassette could lead to diatoms that do not produce the protein. On the other hand, transconjugants with mutations or rearrangements in the genes encoding the fusion ech-fcs protein led to fluorescent signal detection. Here, we show that using fluorescent reporters can mislead the selection of positive transconjugants by not being able to identify rearrangements in the genes of interest, and intact cassettes can lack fluorescent signal due to lack of heterologous protein production.
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Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découle